【摘要】：背景線粒體心肌病(mitochondrial cardiomyopathy)是由心肌組織線粒體呼吸鏈相關(guān)基因缺陷導(dǎo)致的心肌形態(tài)及功能異常的一類疾病。線粒體心肌病涉及的臨床表型有多種,包括肥厚型心肌病、擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)、限制型心肌病以及左心室心肌致密化不全等。線粒體呼吸鏈能量產(chǎn)生過程的關(guān)鍵元件之一是鐵硫簇,而ISCA1(Iron-sulfur cluster assembly 1)是鐵硫簇的重要組裝因子,其對于Fe4S4蛋白的成熟至關(guān)重要,體外實驗發(fā)現(xiàn)Isca1的異�？捎绊懢�粒體呼吸鏈電子傳遞過程,而且關(guān)于Isca1參與的疾病報道主要涉及腦和肌肉。因此,我們推測Isca1對機體另一高耗能器官—心臟同樣具有重要作用。本文擬通過建立系統(tǒng)性Isca1敲除大鼠模型(Isca1-/-)、心肌組織特異性Isca1敲除大鼠模型(Isca1flox/flox/MHC-Cre),來研究Isca1對大鼠機體發(fā)育及心臟形態(tài)與功能的影響,明確Isca1在心臟發(fā)育及心衰病理進(jìn)程中的生物學(xué)作用,為心衰等心血管疾病的防治提供理論依據(jù)和線索。方法1)CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建系統(tǒng)性Isca1敲除大鼠及心肌組織特異性Isca1敲除大鼠大鼠并進(jìn)行繁育。2)ISCA1在大鼠各組織中的定位與表達(dá):PCR技術(shù)檢測Isca于RNA水平在野生大鼠各組織中的表達(dá);熒光定位觀察ISCA1于系統(tǒng)性Isca1敲除大鼠模型中的表達(dá);免疫熒光技術(shù)觀察ISCA1于野生大鼠心肌細(xì)胞中的定位;Western blot檢測ISCA1于心肌病患者及心肌病小鼠模型心肌組織中的蛋白水平。3)PCR技術(shù)鑒定系統(tǒng)性Isca1敲除大鼠及心肌組織特異性Isca1敲除大鼠基因型,并進(jìn)行生存率分析。4)系統(tǒng)性Isca1敲除大鼠胚胎發(fā)育分析:制備系統(tǒng)性Isca1敲除大鼠2.5日齡胚胎和8.5日齡胚胎并通過顯微拍照進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察;PCR技術(shù)鑒定胚胎基因型。5)心肌組織特異性Isca1敲除大鼠心臟形態(tài)及功能分析:6.5日齡敲除大鼠心臟大體解剖及心重/體重比記錄;核磁共振影像檢測0.5日齡、2.5日齡及6.5日齡敲除大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能;超聲影像檢測胚胎17.5日齡、胚胎20.5日齡、0.5日齡、2.5日齡及6.5日齡Isca1敲除大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能;HE染色和透射電鏡觀察6.5日齡敲除大鼠病理學(xué)變化。6)能量代謝相關(guān)分析:Western blot技術(shù)分析系統(tǒng)性Isca1敲除大鼠8.5日齡胚胎大鼠NDUFA9和AC02蛋白水平。Western blot檢測心肌組織特異性Isca1敲除大鼠線粒體呼吸鏈相關(guān)蛋白水平;比色法檢測線粒體呼吸鏈相關(guān)酶活性;比色法測定心肌組織ATP含量。結(jié)果1.系統(tǒng)性Isca1敲除大鼠的建立、表型觀察及機制分析1)使用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建系統(tǒng)性Isca1敲除大鼠模型,并依據(jù)測序結(jié)果選定所需基因型大鼠。2)在RNA水平上,Isca1在心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、肌肉、脂肪、腦各組織中均有不同程度的表達(dá),并在脾臟、腦、心臟中表達(dá)較高,在肝臟中表達(dá)較低;蛋白熒光定位觀察發(fā)現(xiàn)ISCA1于大鼠各組織中廣泛表達(dá),并于心臟、肌肉、肝臟、腎臟、睪丸等部位表達(dá)較高;3)系統(tǒng)性敲除大鼠繁育過程中,子代無純合子,系統(tǒng)性Isca1敲除大鼠純合子胚胎于4細(xì)胞期(胚胎2.5日齡)正常發(fā)育,但在胚胎8.5日齡時胚胎出現(xiàn)發(fā)育異�；虬l(fā)育阻滯;純合子胚胎的NDUFA9蛋白水平下調(diào),AC02蛋白水平上調(diào),均有顯著性差異(P0.05)。2.心肌組織特異性Isca1敲除大鼠的建立、表型觀察及機制分析1)ISCA1在心肌組織特異性Isca1敲除大鼠的心肌組織內(nèi)敲除效率高于90%;ISCA1主要定位于心肌線粒體內(nèi);在心肌病患者及心肌病小鼠模型心肌組織內(nèi)表達(dá)增高。2)心肌組織特異性Isca敲除大鼠子代純合子于出生后7～10天全部死亡;6.5日齡心肌組織特異性Isca1敲除純合子大鼠呼吸虛弱,處于瀕死狀態(tài),大體解剖發(fā)現(xiàn)心臟整體增大,心重/體重比增加(P0.05);核磁共振影像和超聲影像分析顯示,6.5日齡敲除大鼠心臟整體增大,心腔擴張,心功能下降,出現(xiàn)重度心衰;我們觀察了胚胎期17.5及20.5日齡,出生后0.5、2.5及6.5日齡,共5個時間點,我們發(fā)現(xiàn)敲除大鼠的病理表型呈漸進(jìn)性發(fā)展的特點,且于胚胎期17.5日齡敲除大鼠與同窩正常對照大鼠相比已無差異。3)6.5日齡時,心肌組織特異性Isca1敲除大鼠心肌組織內(nèi)線粒體復(fù)合物Ⅰ亞基NDUFA9和NDUFS3蛋白、線粒體復(fù)合物Ⅱ亞基SDHB蛋白水平顯著下調(diào)(P0.01);AC02、線粒體復(fù)合物Ⅲ亞基UQCRC2和線粒體復(fù)合物Ⅳ亞基COXⅣ蛋白無顯著性變化(P0.05)。線粒體復(fù)合物Ⅰ、線粒體復(fù)合物Ⅱ、線粒體復(fù)合物Ⅳ酶活性均顯著降低(P0.01)。結(jié)論ISCA1在大鼠全身各組織內(nèi)廣泛表達(dá),且在心臟及肌肉等高耗能器官表達(dá)較高;Isca1全敲除可導(dǎo)致大鼠胚胎發(fā)育異常,且出現(xiàn)于胚胎8.5日齡左右,胚胎內(nèi)線粒體呼吸鏈關(guān)鍵蛋白NDUFA9水平下調(diào)、AC02水平上調(diào),提示線粒體能量代謝異常;心肌組織特異性Isca1敲除可引起大鼠心腔擴張,心功能下降,并于出生后6-8天呈現(xiàn)心衰,直至死亡,心肌組織內(nèi)線粒體呼吸鏈復(fù)合物相關(guān)分子表達(dá)及活性異常,提示ISCA1在機體發(fā)育,特別是心臟發(fā)育進(jìn)程中發(fā)揮重要作用,推測ISCA1在參與的線粒體能量代謝過程發(fā)揮了重要作用,該研究為ISCA1生物學(xué)功能的明確及心衰等心血管病的防治提供了新的依據(jù)和線索。
【圖文】：

（１）系統(tǒng)性Ａｍｉ敲除大鼠模型鑒定引物：逡逑Ｒ－Ｉｓｃａ＼－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｃｒｅ－Ｆ：邋５�。茫粒裕牵牵粒牵粒牵粒粒牵茫裕牵粒牵牵裕茫缅义希遥冢螅悖铮欤恚茫瑁澹颍颍茫颍澹祝裕遥戾澹哄澹担裕茫裕茫粒茫牵茫裕牵裕茫裕裕牵粒裕裕茫裕粒粒牵缅义希遥幔悖迹常卞澹恚茫瑁澹颍颍茫颍澹耍桑遥插澹哄澹担В牵牵裕牵裕粒牵裕茫茫裕茫牵裕裕牵裕牵牵清义希ǎ玻┬募〗M織特異性Ａｒａｌ敲除大鼠模型鑒定引物：逡逑ＲＵ－Ｓ：邋５’ＡＴＧＧＴＴＣＣＡＧＣＡＣＴＴＴＧＡＡＧＧ逡逑Ｒ－／~專懾澹粒哄澹擔(dān)粒粒牽茫裕粒粒裕粒裕牽粒茫粒牽裕牽牽裕牽粒牽牽緬義希ǎ常╁危茫潁寮ㄒ錚哄義希茫潁澹櫻哄澹擔(dān)В粒粒茫粒裕牽茫裕裕茫粒裕茫牽裕茫牽牽裕緬義希茫潁澹粒哄澹擔(dān)牽裕牽茫茫裕裕茫裕茫裕粒茫粒茫茫裕牽茫清義希插迨笛櫸椒ㄥ義希玻畢低承鄖貿(mào)笫蠹靶募∽櫓匾煨裕粒悖媯歟燁貿(mào)笫蟮慕㈠義希玻保畢低承裕螅澹幔燁貿(mào)笫竽Ｐ偷慕㈠義希ǎ保┥杓品槳稿義習(xí)械悖卞灝械悖插義，

本文編號：2666615