【摘要】：前言:硫氧還蛋白還原酶(Thioredoxin Reductase,TrxR)是吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶家族成員之一,該酶是含黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)構(gòu)域的二聚體硒酶。TrxR與硫氧還蛋白(thioredoxin,Trx)和還原型煙酰腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)共同構(gòu)成了硫氧還蛋白系統(tǒng),通過維持Trx還原性在氧化還原調(diào)節(jié)和抗氧化防御中發(fā)揮重要作用。此外,TrxR還參與調(diào)節(jié)炎癥轉(zhuǎn)錄因子激活、細(xì)胞增殖、凋亡抑制和胚胎發(fā)育等。在已分離鑒定的哺乳動(dòng)物TrxR家族成員中,TrxR1主要存在于細(xì)胞漿中,表達(dá)最廣泛,作用最突出。本課題組前期應(yīng)用RT~2Profiler?PCR Array System篩查了高血壓和正常對照個(gè)體血液樣本84個(gè)氧化應(yīng)激及抗氧化相關(guān)基因,結(jié)果顯示TrxR1的編碼基因TRXR1在病例-對照組間表達(dá)差異顯著,提示TrxR1可能在高血壓發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。目前關(guān)于TRXR1的表達(dá)調(diào)控研究多集中于轉(zhuǎn)錄水平,如位于啟動(dòng)子區(qū)的Oct-1,Sp1和Sp3等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件參與調(diào)節(jié)該基因轉(zhuǎn)錄。此外,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)TRXR1的3′-非翻譯區(qū)存在一個(gè)富含AU的元件和一個(gè)硒代半胱氨酸插入元件,且兩者均可能影響mRNA穩(wěn)定性,提示轉(zhuǎn)錄后水平可能也在TRXR1基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。近年來,微小RNA(microRNA,miRNA)作為轉(zhuǎn)錄后水平重要調(diào)節(jié)因子,其靶基因及其生物學(xué)效應(yīng)被廣泛鑒定和研究。迄今為止,未見有關(guān)TRXR1基因miRNA研究報(bào)道,病理?xiàng)l件下TRXR1表達(dá)異常是否由于miRNA途徑介導(dǎo)亦尚不清楚。因此,本研究擬通過生物信息學(xué)預(yù)測、報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、real-time PCR和Western blot等方法探索miRNA調(diào)節(jié)TRXR1及其在高血壓氧化應(yīng)激中的作用。材料與方法:實(shí)驗(yàn)材料1.細(xì)胞系HEK293、HUVEC及細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑2.基因克隆及熒光素酶報(bào)告基因檢測相關(guān)分子生物學(xué)試劑3.Real-time PCR、RT-PCR及Western blot相關(guān)試劑4.總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和TrxR活性檢測相關(guān)試劑和試劑盒5.過氧化氫(H_2O_2)、放線菌素D(轉(zhuǎn)錄抑制劑Actinomycin D)、Tempol(活性氧清除劑)和miR-125a inhibitor6.高血壓及正常對照個(gè)體外周血標(biāo)本共41例實(shí)驗(yàn)方法1.應(yīng)用生物信息學(xué)軟件對TRXR1基因3′-UTR進(jìn)行miRNA靶向預(yù)測以及序列保守性比對分析;2.基因重組技術(shù)構(gòu)建miR-125a表達(dá)載體及TRXR1 3′-UTR螢光素酶報(bào)告載體。應(yīng)用Dual-Glo~(TM)雙熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測miR-125a過表達(dá)或抑制對pGL3-UTR的報(bào)告基因活性的影響;構(gòu)建序列截短的miR-125a啟動(dòng)子(-980~+34)熒光素酶報(bào)告載體,轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,雙熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測H_2O_2及Tempol刺激前后miR-125a基因啟動(dòng)子活性變化;3.real-time PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)檢測miR-125a過表達(dá)或抑制對內(nèi)源性TRXR1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響;real-time PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度和時(shí)間H_2O_2刺激細(xì)胞TRXR1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)變化;Real-time PCR檢測H_2O_2誘導(dǎo)下的細(xì)胞中miR-125a表達(dá)水平;RT-PCR檢測miR-125a初級轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平;轉(zhuǎn)染miR-125a表達(dá)載體,應(yīng)用H_2O_2刺激細(xì)胞,檢測過表達(dá)miR-125a后TRXR1表達(dá)變化;4.試劑盒檢測收集樣本的總抗氧化能力、超氧化物歧化酶(SOD)活性、TrxR活性。結(jié)果:1、應(yīng)用Pictar和TargetScan軟件在TRXR13′-UTR預(yù)測到1個(gè)miR-125a的結(jié)合位點(diǎn);UCSC Genome Bioinformatic對多個(gè)哺乳動(dòng)物的TRXR1序列比較,發(fā)現(xiàn)TRXR1 3′-UTR與miR-125a“種子序列”互補(bǔ)的靶序列在人、小鼠、大鼠、牛和狗具有高度保守性。2、HEK293細(xì)胞中過表達(dá)miR-125a后TRXR13′-UTR野生型報(bào)告載體熒光素酶活性明顯下降,miR-125a抑制劑可使其活性上升;而對miR-125a互補(bǔ)區(qū)突變后的突變型載體給予同樣的處理,報(bào)告基因活性無明顯變化。3、Real-time PCR結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染pmiR-125a后,細(xì)胞內(nèi)源性TRXR1 mRNA水平?jīng)]有明顯改變;而Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)TrxR1蛋白水平明顯下降,該效應(yīng)可被特異性miR-125a inhibitor抑制。4、H_2O_2刺激使細(xì)胞中TRXR1 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)增多;應(yīng)用轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D預(yù)處理后,抑制了H_2O_2誘導(dǎo)的TRXR1 mRNA升高,而蛋白質(zhì)表達(dá)水平仍有一定升高。5、Real-time PCR顯示H_2O_2刺激后miR-125a表達(dá)水平明顯下降,RT-PCR結(jié)果顯示miR-125a初級轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)明顯下降,而活性氧清除劑Tempol預(yù)處理可抑制H_2O_2的作用。6、過表達(dá)miR-125a可抑制H_2O_2誘導(dǎo)的TrxR1蛋白表達(dá),進(jìn)一步表明H_2O_2誘導(dǎo)的TrxR1表達(dá)部分通過降低miR-125a實(shí)現(xiàn)。7、熒光素酶檢測結(jié)果顯示,miR-125a基因啟動(dòng)子(-980~+34)載體中p924-luc報(bào)告基因活性最強(qiáng);H_2O_2抑制miR-125a基因啟動(dòng)子活性。8、高血壓組T-AOC較正常對照增高,血清TrxR活性較正常對照組高,血清miR-125a表達(dá)水平較正常對照組低,且miR-125a表達(dá)水平與TrxR活性呈負(fù)相關(guān)趨勢(r=-0.511)。結(jié)論:1、miR-125a通過與TRXR1 3′-UTR特異序列靶向結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平抑制該基因的表達(dá)。2、miR-125a參與了H_2O_2誘導(dǎo)的TrxR1表達(dá);H_2O_2通過抑制miR-125a啟動(dòng)子活性降低其表達(dá)。3、在本研究高血壓病例-對照人群樣本中,血清miR-125a水平與TrxR活性呈負(fù)相關(guān)趨勢。
【圖文】：

圖 1-1 生物信息學(xué)分析預(yù)測 TRXR1 3′-UTR 潛在結(jié)合的 miRNA 及 TRXR1 3′-UTR 序列在多種哺乳動(dòng)物間的保守性A. Pictar 及 TargetScan 在線軟件預(yù)測人 TRXR1 3′-UTR 結(jié)合 miRNA 的部分結(jié)果；B. miR-125a 與 TRXR1 3′-UTR 互補(bǔ)結(jié)合示意圖；

18圖 1-2 pmiR-125a 載體構(gòu)建及其表達(dá)鑒定A．pmiR-125a 表達(dá)載體示意圖及 pmiR-125a 載體測序峰圖，下劃線標(biāo)示處為 miR-125a 前體序列，，長度為 86bp；B. Real-time PCR 檢測 pmiR-125a 在 HEK293 細(xì)胞中過表達(dá)； C. Western blo
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R544.1

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