【摘要】：研究目的:雌激素受體α和雌激素受體β(ERα和ERβ)在基因、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上具有一定的差異,為其功能差異提供了理論基礎(chǔ)。為更好的區(qū)分ERα與ERβ的功能特異性,本研究主要利用RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)特異性的沉默ERβ的表達(dá),探討ERβ基因沉默對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)細(xì)胞周期的影響。研究方法:根據(jù)RNAi的設(shè)計(jì)原則,構(gòu)建pGFP-U6-Neo-shRNA/ERβ真核表達(dá)載體,將該載體轉(zhuǎn)染至HUVEC細(xì)胞系。通過(guò)RT-qPCR、Western blotting檢測(cè)ERβ基因mRNA及蛋白質(zhì)水平表達(dá)水平的變化。流式細(xì)胞儀檢測(cè)ERβ沉默后的HUVEC細(xì)胞周期。研究結(jié)果:重組質(zhì)粒DNA經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定,結(jié)果均證實(shí)pGFP-U6-Neo-shRNA/ERβ 真 核 表 達(dá) 載體 構(gòu) 建 成 功。將pGFP-U6-Neo-shRNA/ERβ 和 pGFP-U6-Neo-shRNA/NC 空載體分別轉(zhuǎn)染HUVEC,經(jīng)RT-qPCR、Western blotting進(jìn)行鑒定,成功構(gòu)建ERβ表達(dá)沉默的質(zhì)粒。細(xì)胞周期結(jié)果顯示:ERβ基因表達(dá)沉默組與轉(zhuǎn)空白載體組相比較,ERβ基因表達(dá)沉默組細(xì)胞群體中,處于G1期細(xì)胞比例降低,而S期細(xì)胞比例增高,但差異不具有顯著性意義(P0.05)。研究結(jié)論:①針對(duì)人ERβ分別構(gòu)建了 3種shRNA載體,質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定分析證實(shí)目的序列己插入到預(yù)計(jì)位點(diǎn),符合設(shè)計(jì)要求,測(cè)序鑒定表明重組質(zhì)粒中含有針對(duì)ERβ基因的目的序列,表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。②瞬間轉(zhuǎn)染至HUVEC,瞬轉(zhuǎn)的結(jié)果表明:shRNAl載體對(duì)HUVEC在蛋白水平及mRNA抑制水平上最佳,其次為shRNA3,差異具有顯著性意義(P0.05)。③用pGFP-U6-Neo-shRNAl、pGFP-U6-Neo-shRNA2、pGFP-U6-Neo-shRNA/NC轉(zhuǎn)染HUVEC48h,用流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞周期。結(jié)果表明:ERβ基因表達(dá)沉默組,處于G0/G1期細(xì)胞比例降低,而S期細(xì)胞比例增高,但差異不具有顯著性意義(P0.05)。
【圖文】：

圖２－４邋ＮＣ序歹丨Ｊ逡逑

圖２－６酶切圖逡逑３．３構(gòu)建的表達(dá)載體ｐＧＰＵ６邋／邋ＧＦＰ邋／邋Ｎｅｏ－ｓｈＲＮＡ－ＥＲｐ質(zhì)粒測(cè)序鑒定結(jié)果逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R54

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本文編號(hào)：2655340