【摘要】：一、研究背景心房顫動(atrial fibrillation,AF)是最嚴(yán)重的心房電活動紊亂,也是臨床上最常見的心律失常,并伴有較高的致殘率和致死率。AF可逐漸由陣發(fā)性房顫(paroxysmal AF)進(jìn)展為持續(xù)性房顫(persistent AF),是缺血性腦卒中、充血性心力衰竭及全因性死亡率增加的主要危險(xiǎn)因素。目前AF的具體發(fā)生機(jī)制尚不明確,這嚴(yán)重制約著臨床上AF治療的有效性及安全性。Calpain是一類鈣離子依賴激活的半胱氨酸蛋白酶,在鈣超載時(shí)其可轉(zhuǎn)位至胞膜上并大量激活,水解一些蛋白底物,引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞。近來研究發(fā)現(xiàn),房顫患者心房肌組織中激活的Calpain-1可酶解L-型鈣通道(L-type calcium channel,LTCC)、鈉鈣交換體(sodium-calcium exchanger,NCX)等多種心肌細(xì)胞內(nèi)離子通道及結(jié)構(gòu)蛋白。近期發(fā)現(xiàn),位于心肌橫管膜(transverse tubules,T-tubules)與肌漿網(wǎng)(sarcoplasmic reticulum,SR)膜之間的膜偶聯(lián)結(jié)構(gòu)蛋白——親聯(lián)蛋白2(junctophilin-2,JP2)可以通過穩(wěn)定肌漿網(wǎng)鈣通道雷尼丁受體2(ryanodine receptor 2,RyR2)而發(fā)揮調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的作用,而鈣穩(wěn)態(tài)異常被認(rèn)為是AF發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一。此外,在缺血再灌注損傷、心力衰竭等動物模型中,均發(fā)現(xiàn)JP2蛋白可被激活的Calpain-1所降解,提示JP2也是Calpain-1的降解底物蛋白之一。因此我們推測,在心房快速搏動、氧化應(yīng)激等刺激條件下,心房肌內(nèi)Calpain-1激活可通過降解重要鈣穩(wěn)定蛋白JP2等底物,促進(jìn)房顫的發(fā)生與維持;而維持正常水平的JP2蛋白可減少RyR2的異常鈣泄漏,抑制延遲后除極(delayed afterdepolarization,DAD)等電觸發(fā)活動、以及可能的心房重構(gòu)的發(fā)生,從而發(fā)揮其維持正常心律的關(guān)鍵作用。二、研究目的(一)明確JP2及Calpain-1在房顫患者及實(shí)驗(yàn)性房顫模型中的表達(dá)規(guī)律(二)闡明Calpain-1抑制劑通過調(diào)控JP2在小鼠房顫模型中的作用及機(jī)制(三)探討JP2蛋白水平變化影響小鼠房顫易感性的作用及機(jī)制研究三、研究方法(一)Calpain-1及JP2在房顫患者和實(shí)驗(yàn)性房顫模型中的變化規(guī)律研究1.收集于我科行體外循環(huán)下冠狀動脈搭橋術(shù)或者二尖瓣外科手術(shù)患者的心房肌標(biāo)本,其中術(shù)前診斷為持續(xù)性AF者28例,維持正常竇性心律(normal sinus rhythm,NSR)者16例,于體外循環(huán)轉(zhuǎn)機(jī)前采集標(biāo)本,迅速轉(zhuǎn)移至醫(yī)院生物樣本庫。檢測心房肌組織中JP2及Calpain-1的蛋白表達(dá)變化,以及Calpain-1酶活性的變化情況。2.選取共計(jì)18只成年新西蘭大白兔(2.0~2.5 kg,雄性)為實(shí)驗(yàn)對象,按照隨機(jī)數(shù)法分別納入假手術(shù)組(sham)和RAP組(2 w、4 w),其中每組6只。沿胸骨左緣第3肋間打開胸腔,暴露心臟,將起搏電極頭端縫合固定于左心房游離壁.起搏電極尾端縫合固定于胸腹壁位置上并通過皮下與起搏器相接。起搏器起搏模式為AOO,刺激頻率為1000 bpm,連續(xù)刺激4 w,以建立快速心房起搏(rapid atrial pacing,RAP)兔AF模型。檢測心房肌組織中JP2及Calpain-1的蛋白表達(dá)變化,以及Calpain-1酶活性的變化情況。(二)Calpain-1抑制劑調(diào)控JP2在小鼠房顫模型中的作用及機(jī)制研究1.實(shí)驗(yàn)動物的選擇及分組本實(shí)驗(yàn)中,我們采用誘導(dǎo)性基因調(diào)控“Tet-off”系統(tǒng)構(gòu)建心臟特異性Calpain-1過表達(dá)小鼠(CAPN 1-OE)模型,作為房顫小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ�。在該系統(tǒng)中融合表達(dá)四環(huán)素(Tetracycline,Tet)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄激活子(tet-controlled transcriptional activator,tTA),在缺少四環(huán)素或者強(qiáng)力霉素(doxycycline,Dox)時(shí),tTA可以激活目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄;在四環(huán)素或者強(qiáng)力霉素作用下,缺少增強(qiáng)子使目的基因表達(dá)量很低或無法表達(dá)。開展作用及機(jī)制研究的時(shí)間點(diǎn)為撤除Dox藥物飼料(即Tet-off系統(tǒng)開始目的基因過表達(dá))后8周。在該時(shí)間點(diǎn),分為以下三組,即對照組(control),Calpain-1過表達(dá)組(CAPN 1-OE),以及Calpain-1過表達(dá)同時(shí)給予Calpain抑制劑(MDL28170,10 mg/kg,1/日,腹腔注射)處理組(CAPN 1-OE+MDL)。本部分納入實(shí)驗(yàn)小鼠共計(jì)75只,其中選擇無Calpain-1過表達(dá)的αMHC-tTA小鼠(Calpain/tTA-/+)作為對照組,雌雄不限,共計(jì)25只;選擇心臟特異性Calpain-1過表達(dá)組小鼠(Calpain/tTA+/+),雌雄不限,共計(jì)50只,采用隨機(jī)數(shù)字法分為CAPN1-OE組和CAPN 1-OE+MDL組,每組25只。2.Calpain抑制劑調(diào)控小鼠房顫易感性的作用研究采用STG-3008型多通道電刺激器(MultiChannel Systems,Germany),通過連接Millar 1.1F多電極電生理導(dǎo)管(EPR-800,Millar Instruments),外接Labchart Pro信號采集系統(tǒng)(AD Instruments,Australia)同時(shí)記錄心臟表面電信號和體表心電圖,明確食管腔內(nèi)電刺激導(dǎo)管的合適位置,開展經(jīng)食管心臟程序性電刺激和記錄。采用經(jīng)食管心臟程序性電刺激方法檢測各組小鼠AF的誘發(fā)率和持續(xù)時(shí)間的變化情況。3.標(biāo)本收集完成相應(yīng)電生理檢測后,處死小鼠收集心臟標(biāo)本,用于后續(xù)分子生物學(xué)、共聚焦成像等實(shí)驗(yàn)研究。采用Western blot檢測各組心房組織JP2表達(dá)變化;采用活性檢測試劑盒,評估各組心房組織Calpain 1的酶活性。4.Calpain抑制劑調(diào)節(jié)小鼠心房肌細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)的機(jī)制研究通過Langendorff灌流酶解法成功分離成年小鼠心房肌細(xì)胞,進(jìn)行5μM Fluo-4AM鈣熒光標(biāo)記后在激光共聚焦顯微鏡下檢測鈣穩(wěn)態(tài)變化情況。激發(fā)波長/發(fā)射波長分別為488 nm/505 530 nm。刺激強(qiáng)度15 V/cm,頻率1 Hz的規(guī)律電刺激暫停5 s后,檢測鈣火花(Ca~(2+)sparks)發(fā)生頻率的變化。在此基礎(chǔ)上,為了進(jìn)一步明確撤藥4周時(shí)JP2-OE的保護(hù)作用機(jī)制,采用鈣指示劑(5μM Rhod-2 AM)小鼠心臟整體灌流的方法,原位觀察整個(gè)心房組織(in situ whole heart imaging)的鈣穩(wěn)態(tài)異常,如鈣波(Ca~(2+)waves)的發(fā)生頻率情況。5.Calpain抑制劑調(diào)節(jié)小鼠心房肌細(xì)胞電重構(gòu)的機(jī)制研究采用經(jīng)食管心臟程序性電刺激方法,行S1S2刺激,比較心房有效不應(yīng)期(atrial effective refractory period,AERP)的變化情況;采用心臟整體灌流心肌細(xì)胞膜熒光指示劑(5μM MM 4-64)30 min后,原位觀察整個(gè)心房組織橫管(Transverse tubules,T-tubules)結(jié)構(gòu)的變化情況。6.Calpain抑制劑調(diào)節(jié)小鼠心房肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)的機(jī)制研究在進(jìn)行完相應(yīng)電生理實(shí)驗(yàn)之后,剪取小鼠心房肌組織稱重(atrium weight),測量小鼠脛骨長度(tibia length),計(jì)算心房重量/脛骨長度(atrium weight/tibia length,AW/TL);小鼠心臟4%PFA灌流固定處理后,采用Masson trichrome染色法,檢測小鼠心房纖維化程度;剪取小鼠心房肌標(biāo)本,采用Western blot檢測心房中轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor,TGF)-β1,α-平滑肌肌動蛋白(smooth muscle actin,SMA),以及I型膠原蛋白(collagen I,Col I)等經(jīng)典促纖維化信號通路的蛋白表達(dá)變化。(三)JP2蛋白水平變化調(diào)控小鼠房顫易感性的作用及機(jī)制研究1.心肌特異性JP2過表達(dá)小鼠、Calpain-1/JP2雙基因共同過表達(dá)小鼠模型的構(gòu)建本實(shí)驗(yàn)中,我們首先構(gòu)建了心肌特異性JP2過表達(dá)小鼠(JP2-OE),并將其與業(yè)已建立的Calpain-1過表達(dá)小鼠(CAPN 1-OE)雜交,以產(chǎn)生Calpain和JP2共同過表達(dá)小鼠(CAPN 1-OE×JP2-OE)。2.實(shí)驗(yàn)動物的選擇及分組按照基因型不同,本部分實(shí)驗(yàn)分為以下三組,即對照組小鼠(control),Calpain-1過表達(dá)小鼠(CAPN 1-OE)以及Calpain和JP2共同過表達(dá)小鼠(CAPN 1-OE×JP2-OE)。共計(jì)納入小鼠75只,其中選擇有且僅有tTA基因陽性表達(dá),即Calpain/tTA-/+或Calpain/JP2/tTA-/-/+的基因型小鼠作為對照組,雌雄不限,共計(jì)25只;選擇僅Calpain-1心臟特異性過表達(dá)組小鼠(Calpain/tTA+/+或Calpain/JP2/tTA+/-/+)為CAPN1-OE組,雌雄不限,共計(jì)25只;選擇心臟特異性Calpain-1/JP2共同過表達(dá)組小鼠(Calpain/tTA+/+或Calpain/JP2/tTA+/-/+)為CAPN 1-OE×JP2-OE組,雌雄不限,共計(jì)25只。在此基礎(chǔ)上,按照撤除Dox藥物飼料(即Calpain或者Calpain/JP2過表達(dá)激活)的時(shí)間,再細(xì)分為撤Dox飼料4周組(Dox withdrawal 4 w),以及撤Dox藥物飼料8周組(Dox withdrawal 8 w)。每個(gè)時(shí)間段的系列實(shí)驗(yàn)動物分組同上,因此本部分實(shí)驗(yàn)共計(jì)納入小鼠150只。3.各組小鼠心功能基線變化情況電生理實(shí)驗(yàn)開始之前,利用超聲心動圖檢測各組小鼠心臟功能的變化情況,如左室射血分?jǐn)?shù)(Left ventricular ejection fraction,LVEF),收縮末左室容積(end-systolic volume,ESV),以及舒張末左室容積(end-diastolic volume,EDV)等;并評估整體心臟重構(gòu)改變,比較各組小鼠心臟重量/體重(heart weight/body weight,HW/BW)以及肺臟重量/體重(lung weight/body weight,LW/BW)的變化情況。4.JP2過表達(dá)對小鼠房顫易感性的作用研究實(shí)驗(yàn)方法同第二部分。在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn),采用經(jīng)食管心臟程序性電刺激,首先行不同基礎(chǔ)刺激周長(basic cycle length,BCL)的連續(xù)短陣S1S1刺激,比較標(biāo)準(zhǔn)竇房結(jié)恢復(fù)時(shí)程(corrected sinus node recovery time,cSNRT)的變化情況,評價(jià)竇房結(jié)功能變化;采用burst電刺激方案,檢測三組小鼠AF的誘發(fā)率和持續(xù)時(shí)間的變化情況。5.標(biāo)本采集完成相應(yīng)電生理實(shí)驗(yàn)之后,處死小鼠收集心臟標(biāo)本,用于后續(xù)分子生物學(xué)、共聚焦成像等實(shí)驗(yàn)研究。采用Western blot檢測心房中JP2及Calpain-1的蛋白表達(dá)水平變化;采用鈣蛋白酶Calpain活性檢測試劑盒,評估各組小鼠心房肌組織中Calpain 1的酶活性變化情況。6.JP2調(diào)節(jié)CAPN 1-OE小鼠鈣穩(wěn)態(tài)的機(jī)制研究實(shí)驗(yàn)方法同第二部分。檢測各組小鼠心房肌細(xì)胞鈣火花發(fā)生頻率變化情況;采用鈣熒光指示劑心臟整體灌流方法,原位觀察心房組織的鈣波等鈣泄漏事件發(fā)生情況。7.JP2調(diào)控CAPN 1-OE小鼠心房電重構(gòu)的機(jī)制研究經(jīng)食管心臟電刺激程序同第二部分。檢測各組小鼠心房有效不應(yīng)期AERP的變化情況;采用離體心臟原位T管成像技術(shù),檢測左右心房組織T管結(jié)構(gòu)重構(gòu)情況。8.JP2調(diào)節(jié)CAPN 1-OE小鼠結(jié)構(gòu)重構(gòu)的機(jī)制研究實(shí)驗(yàn)方法同第二部分。采用大體標(biāo)本成像、心房重量/脛骨長度AW/TL評價(jià)三組小鼠心房腔擴(kuò)大情況;采用Masson染色法,檢測各組小鼠心房纖維化程度;采用Western blot方法,檢測各組小鼠心房組織中TGF-β1,α-SMA,以及Col I的蛋白表達(dá)水平變化。四、研究結(jié)果(一)Calpain-1及JP2在房顫患者和實(shí)驗(yàn)性房顫模型中的變化及相關(guān)性研究1.房顫患者心肌標(biāo)本中JP2及Calpain-1的表達(dá)規(guī)律持續(xù)性房顫患者心房肌組織中JP2蛋白表達(dá)水平顯著下降,Calpain-1蛋白水平及其酶活性均顯著升高,心房肌JP2蛋白水平與Calpain-1蛋白酶活性成顯著負(fù)相關(guān)。2.快速心房起搏兔房顫模型中JP2及Calpain-1的表達(dá)規(guī)律在RAP兔房顫模型中,隨著高頻心房起搏時(shí)程延長,心房肌組織中JP2蛋白表達(dá)水平逐漸下降,Calpain-1蛋白水平及酶活性逐漸升高,心房肌JP2蛋白水平與Calpain-1蛋白酶活性成顯著負(fù)相關(guān)。(二)Calpain-1抑制劑調(diào)控JP2在小鼠房顫模型中的作用及機(jī)制研究1.Calpain抑制劑顯著改善CAPN 1-OE小鼠異常升高的房顫易感性同對照組小鼠相比,CAPN 1-OE 8周組小鼠其房顫的誘發(fā)率顯著升高,房顫事件持續(xù)時(shí)長明顯延長。而在撤除Dox藥物飼料即日起,開始腹腔注射Calpain抑制劑MDL28170,結(jié)果提示,CAPN 1-OE+MDL處理組中,小鼠房顫誘發(fā)率、持續(xù)時(shí)間的異常升高均明顯改善。2.Calpain抑制劑顯著改善CAPN 1-OE小鼠心房肌Calpain-1的過度激活同對照組小鼠相比,CAPN 1-OE小鼠心房肌組織Calpain 1的酶活性顯著升高,伴有JP2蛋白表達(dá)水平明顯下降,而CAPN 1-OE+MDL小鼠心房肌組織中的Calpain1的酶活性顯著降低,而JP2蛋白表達(dá)水平得以明顯恢復(fù)。3.Calpain抑制劑顯著改善CAPN 1-OE小鼠心房肌細(xì)胞異常鈣穩(wěn)態(tài)同對照組小鼠相比,CAPN 1-OE 8周組小鼠心房肌細(xì)胞鈣火花異常增多;采用心臟整體鈣成像技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)心房肌中異常鈣波發(fā)生頻率明顯增多。CAPN 1-OE+MDL處理組中,上述鈣火花頻率增高等異常鈣穩(wěn)態(tài)現(xiàn)象明顯改善,而在心臟整體灌流鈣熒光指示劑染色成像中,結(jié)果提示MDL處理可以明顯改善CAPN 1-OE小鼠心房肌的鈣穩(wěn)態(tài)異常。4.Calpain抑制劑可以明顯改善CAPN 1-OE小鼠心房電重構(gòu)同對照組小鼠相比,CAPN 1-OE 8周組小鼠心房肌AERP大幅縮短,而CAPN 1-OE+MDL小鼠心房肌AERP這一關(guān)鍵電重構(gòu)指標(biāo)明顯改善。原位觀測小鼠心房肌細(xì)胞中T管結(jié)果提示,在撤除Dox藥物飼料8周時(shí),CAPN 1-OE小鼠左、右心房肌細(xì)胞中T管形態(tài)明顯紊亂,結(jié)構(gòu)消失,而MDL處理組可使CAPN 1-OE小鼠原位心房肌細(xì)胞中的T管系統(tǒng)的完整性明顯改善。5.Calpain抑制劑可以明顯改善CAPN 1-OE小鼠心房肌的結(jié)構(gòu)重構(gòu)CAPN 1-OE 8周組小鼠心房可見顯著的雙心房腔擴(kuò)大,且AW/TL顯著增大,Masson染色提示心肌纖維化明顯增多,WB結(jié)果顯示心房肌組織中TGF-β1,α-SMA以及Col I等纖維化相關(guān)指標(biāo)均明顯激活;而Calpain抑制劑MDL處理后,CAPN 1-OE小鼠心房擴(kuò)張、心室肥厚顯著改善,WB結(jié)果提示心房肌組織中TGF-β1,α-SMA以及Col I等蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào),Masson染色同樣證實(shí)了CAPN 1-OE+MDL小鼠心房肌纖維化程度的改善。(三)JP2蛋白水平變化調(diào)控小鼠房顫易感性的作用及機(jī)制研究1.成功建立了Calpain-1/JP2雙基因共同過表達(dá)小鼠模型在該部分,首先建立了心肌特異性JP2過表達(dá)小鼠(JP2-OE)。與對照組小鼠相比,在撤除Dox藥物飼料4周,即JP2過表達(dá)激活4周時(shí),JP2-OE小鼠的心房肌組織中JP2的蛋白表達(dá)水平顯著增高;將JP2-OE小鼠與CAPN 1-OE小鼠雜交,即可得到Calpain-1/JP2雙基因共同過表達(dá)小鼠模型(CAPN 1-OE×JP2-OE)。2.在撤除Dox藥物飼料4周時(shí),心臟超聲結(jié)果提示各組小鼠左室功能未見明顯異常超聲心動圖結(jié)果顯示,對照組小鼠,CAPN 1-OE小鼠以及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠等3組小鼠,其左室射血分?jǐn)?shù)LVEF,收縮末左室容積ESV,以及舒張末左室容積EDV等未見顯著差別;取小鼠心臟、肺臟等稱重后,各組小鼠心臟重量/體重HW/BW、肺臟重量/體重LW/BW的變化情況等未見顯著差別。3.在撤除Dox藥物飼料8周時(shí),CAPN 1-OE小鼠以及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠均出現(xiàn)較明顯的左室功能受損超聲心動圖結(jié)果顯示,同對照組小鼠相比,CAPN 1-OE小鼠以及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠等,其LVEF顯著下降,而ESV及EDV等指標(biāo)顯著升高,提示存在明顯的左心收縮舒張功能障礙;此外,CAPN 1-OE小鼠以及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠等HW/BW顯著增大,但LW/BW未見顯著差別,提示存在顯著的心臟肥厚,但未見明顯的肺臟淤血等。4.三組小鼠竇房結(jié)傳導(dǎo)功能均未見明顯異常在撤除Dox藥物飼料4周時(shí),檢測三組小鼠心房標(biāo)準(zhǔn)竇房結(jié)恢復(fù)時(shí)程cSNRT后發(fā)現(xiàn),對照組小鼠、CAPN 1-OE小鼠及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠中該指標(biāo)均未見異常,提示CAPN 1-OE和/或JP2-OE并未對小鼠竇房結(jié)功能產(chǎn)生影響。在撤除Dox藥物飼料8周時(shí),對照組小鼠、CAPN 1-OE小鼠及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠中該指標(biāo)變化均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示竇房結(jié)功能仍維持正常水平。5.三組小鼠心房肌組織中Calpain-1酶活性的變化情況JP2過表達(dá)4周,CAPN 1-OE小鼠、CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房肌組織中Calpain-1酶活性均顯著上升;JP2過表達(dá)8周時(shí),CAPN 1-OE小鼠、CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房肌Calpain-1酶活性呈進(jìn)一步升高。提示JP2-OE并不能改變Calpain-1酶活性。6.在撤除Dox藥物飼料4周時(shí),JP2-OE可顯著降低CAPN 1-OE小鼠房顫的誘發(fā)率和持續(xù)時(shí)間同對照組小鼠相比,CAPN 1-OE小鼠經(jīng)burst電刺激后可誘發(fā)出房顫的比例顯著增高,而JP2-OE可使CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠房顫的誘發(fā)率明顯降低,且房顫事件發(fā)作持續(xù)時(shí)間也明顯縮短。7.在撤除Dox藥物飼料8周時(shí),JP2-OE未能改善CAPN 1-OE小鼠明顯升高的房顫誘發(fā)率CAPN 1-OE小鼠經(jīng)burst電刺激后房顫誘發(fā)率顯著增高,而JP2-OE并未使能顯著改善CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠房顫的誘發(fā)率,但仍可明顯縮短房顫事件的發(fā)作持續(xù)時(shí)間。8.三組小鼠心房肌JP2蛋白表達(dá)水平變化情況在撤除Dox藥物飼料4周時(shí),JP2-OE可顯著改善CAPN 1-OE小鼠心房肌組織內(nèi)的JP2蛋白表達(dá)水平;但在撤除Dox藥物飼料8周時(shí)則無法維持心房肌JP2正常水平,CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房肌組織中的JP2蛋白含量也顯著下降。提示JP2表達(dá)水平逐漸下降,是導(dǎo)致CAPN 1-OE小鼠房顫易感性增加的機(jī)制之一,而維持正常水平的JP2蛋白水平,是JP2-OE發(fā)揮調(diào)節(jié)房顫易感性的蛋白基礎(chǔ)。9.JP2過表達(dá)4周對房顫小鼠心房鈣穩(wěn)態(tài)異常的調(diào)控作用同對照組相比,CAPN 1-OE小鼠心房肌細(xì)胞中可見明顯異常增多的自發(fā)性鈣火花,而JP2-OE可使CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房肌細(xì)胞中鈣火花發(fā)生頻率明顯改善。此外,離體心臟原位鈣成像結(jié)果提示,同對照組相比,CAPN 1-OE小鼠心房肌中自發(fā)性鈣波等異常鈣釋放事件顯著增多,而JP2-OE可使CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠原位心房肌中鈣波發(fā)生頻率明顯改善,該離體心臟原位鈣成像的結(jié)論與分離的單個(gè)心房肌細(xì)胞的結(jié)果趨勢一致。10.JP2過表達(dá)8周對房顫小鼠心房鈣穩(wěn)態(tài)異常的調(diào)控作用同對照組相比,CAPN 1-OE及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房肌細(xì)胞中可見明顯異常增多的自發(fā)性鈣火花。此外,離體心臟原位鈣成像結(jié)果提示,同心房肌鈣波發(fā)生頻率異常增多的CAPN 1-OE小鼠相比,CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房肌自發(fā)性鈣波發(fā)生頻率未見明顯減少,該離體心臟原位鈣成像的結(jié)論與分離的單個(gè)心房肌細(xì)胞的結(jié)果趨勢一致。11.JP2過表達(dá)4周對房顫小鼠心房電重構(gòu)的影響同對照組相比,CAPN 1-OE小鼠經(jīng)食管程序性S1S2電刺激后可發(fā)現(xiàn)其AERP顯著縮短,而JP2-OE可使CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠的AERP得以明顯改善;而原位觀測小鼠心房肌細(xì)胞中T管系統(tǒng)結(jié)果提示,在撤除Dox藥物飼料4周時(shí),CAPN 1-OE小鼠左、右心房肌細(xì)胞中T管形態(tài)明顯紊亂,結(jié)構(gòu)消失,而對照組小鼠心房肌細(xì)胞內(nèi)可見規(guī)律存在的T管,且廣泛分布于大部分心房肌細(xì)胞中,JP2-OE可使CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠原位心房肌細(xì)胞中的T管系統(tǒng)的完整性明顯改善,完整、規(guī)律排列的T管系統(tǒng)有助于細(xì)胞電信號的精細(xì)傳遞。12.JP2過表達(dá)8周對房顫小鼠心房電重構(gòu)的影響同對照組相比,CAPN 1-OE及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠經(jīng)S1S2食管電刺激后發(fā)現(xiàn)AERP均顯著縮短;而原位觀測小鼠心房肌細(xì)胞中T管系統(tǒng)結(jié)果提示,JP2過表達(dá)8周時(shí),CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房T管系統(tǒng)的完整性未見明顯改善,提示此時(shí)JP2過表達(dá)未能有效改善房顫小鼠的電重構(gòu)。13.JP2過表達(dá)4周對房顫小鼠心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的影響同對照組相比,CAPN 1-OE小鼠心房重量/脛骨長度AW/TL明顯增大,而JP2-OE可使CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠AW/TL明顯改善,而大體心臟標(biāo)本也可得出同一結(jié)論,肉眼可見CAPN 1-OE小鼠雙心房,尤其是左心房明顯擴(kuò)大,而CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房腔擴(kuò)大明顯改善;心房肌組織纖維化也是房顫維持的重要基質(zhì)改變。Masson染色結(jié)果提示,同對照組相比,CAPN 1-OE及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠的心房纖維化程度均顯著增高,WB結(jié)果顯示CAPN 1-OE及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠的心房肌組織中經(jīng)典促纖維化信號通路TGF-β1/α-SMA/Col I均明顯激活,提示JP2-OE參與調(diào)控小鼠心房腔的大小,未能有效改善房顫小鼠心房纖維化信號通路的激活。14.JP2過表達(dá)8周對房顫小鼠心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的影響JP2過表達(dá)8周時(shí),同CAPN 1-OE小鼠相比,CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房腔的擴(kuò)大未得到有效抑制。Masson染色結(jié)果提示,同對照組相比,CAPN 1-OE及CAPN1-OE×JP2-OE小鼠的心房纖維化程度均進(jìn)一步增高。五、研究結(jié)論1.在房顫患者及房顫實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?隨著心房快速刺激持續(xù)存在,心房肌組織中JP2蛋白表達(dá)水平逐漸降低,而Calpain-1表達(dá)明顯上調(diào)且其酶活性顯著激活,且心房肌JP2蛋白水平與Calpain-1蛋白酶活性成顯著負(fù)相關(guān);2.在CAPN 1-OE小鼠房顫模型中,JP2蛋白是Calpain-1重要降解底物之一。在Calpain-1蛋白過表達(dá)8周時(shí),MDL28170通過顯著抑制Calpain-1酶活性,并改善心房肌蛋白JP2的表達(dá)水平,顯著改善房顫的易感性;3.心房肌細(xì)胞JP2蛋白的變化,可通過調(diào)節(jié)房顫小鼠心房肌細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)(鈣火花、鈣波等鈣異常釋放事件),進(jìn)而影響心房電重構(gòu)(AERP變化、T管結(jié)構(gòu)重構(gòu))及結(jié)構(gòu)重構(gòu)(心房腔擴(kuò)大、心房纖維化),從而影響小鼠房顫易感性(房顫的發(fā)生率及持續(xù)時(shí)間);JP2-OE作為潛在的治療房顫的可能手段,其調(diào)控房顫易感性的作用有一定的時(shí)程性。
【圖文】：

圖 1-1 持續(xù)性房顫患者心肌組織中 JP2 蛋白表達(dá)水平顯著降低Fig 1-1. The expression level of JP2 protein in atrial myocardium decreased significantlinAF patients.

持續(xù)性房顫患者心肌組織中 Calpain-1 蛋白表達(dá)水平及酶活性顯著升高2. The expression level and activity of Calpain-1 in atrial myocardium iy inAF patients. 臨床患者心房肌組織中 JP2 蛋白水平與 Calpain-1 蛋白酶活性成顯著負(fù)3.The atrial JP2expression level was negativelycorelatedwith theactivityofrial samples of patients.
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R541.75

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本文編號：2650558