【摘要】：背景:動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是一種以脂質(zhì)異常聚積動(dòng)脈管壁為典型特征的病理學(xué)表現(xiàn),其引發(fā)的心腦血管系統(tǒng)疾病正嚴(yán)重危害人類健康與生命。其中內(nèi)皮功能障礙(ED)被認(rèn)為是AS形成發(fā)展過程中啟動(dòng)環(huán)節(jié)之一,改善和預(yù)防內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂一直是防治AS的探討熱點(diǎn)和研究難點(diǎn)。硒蛋白S(Sel S)是一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的單次跨膜蛋白,其組織分布廣泛,在肝臟、脂肪、骨骼肌、腎臟、胰島及血管等器官組織中均有表達(dá)。Sel S主要生物學(xué)功能包括調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、抵抗氧化應(yīng)激、調(diào)控炎癥反應(yīng)及參與糖脂代謝。在促炎癥因子中,腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是代謝性疾病及炎癥性疾病中致ED關(guān)鍵影響因子之一,目前Sel S在血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂中的作用尚不清楚,故本研究探討Sel S對(duì)TNF-α誘導(dǎo)內(nèi)皮功能紊亂的影響及其相關(guān)機(jī)制。方法:高脂飲食(HFD)喂養(yǎng)低密度脂蛋白受體基因敲除(LDLR KO)小鼠16周,免疫組化檢測(cè)該小鼠主動(dòng)脈含生長(zhǎng)因子樣模體粘液樣激素樣受體(EMR1,又稱F4/80)、腫瘤壞死因子受體-1(TNFR-1)、磷酸化的核因子-κB p65(p-NF-κB p65)及Sel S表達(dá)水平;應(yīng)用外源性重組人TNF-α及相關(guān)通路抑制劑處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs),采用蛋白免疫印跡及實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等方法觀察TNF-α誘導(dǎo)HUVECs功能紊亂的情況并明確TNF-α誘導(dǎo)HUVECs功能紊亂的分子機(jī)制;應(yīng)用DNA重組技術(shù)構(gòu)建pc DNA3.1-Sel S重組質(zhì)粒及RNA干擾技術(shù)構(gòu)建Sel S特異性小干擾RNAs以調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞Sel S表達(dá),從而研究Sel S對(duì)TNF-α誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂的影響及相關(guān)機(jī)制。結(jié)果:HFD喂養(yǎng)的LDLR KO小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化病變區(qū)炎性指標(biāo)及Sel S表達(dá)升高:與普通飲食喂養(yǎng)小鼠相比,HFD喂養(yǎng)的LDLR KO小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化病變區(qū)F4/80表達(dá)增多(0.11±0.01 vs 0.06±0.01,p0.01)、TNFR-1表達(dá)增多(0.010±0.004 vs 0.003±0.003,p0.01)、p-NF-κB p65表達(dá)增多(0.010±0.004 vs0.003±0.002,p0.01)及Sel S表達(dá)增多(0.06±0.02 vs 0.010±0.004,p0.01)。TNF-α誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂:與對(duì)照組比較,TNF-α組細(xì)胞存活率降低[(53.93±11.20)(%)vs(93.42±7.63)(%),p0.01]、一氧化氮(NO)含量降低(1.07±0.22 mmol/ml vs 2.12±0.28 mmol/ml,p0.01)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(e NOS)m RNA水平下降(0.56±0.11 vs 1.01±0.16,p0.05)、e NOS蛋白表達(dá)減少(0.55±0.17 vs 2.17±0.23,p0.01),而內(nèi)皮素-1(ET-1)m RNA水平升高(6.45±1.06 vs 0.93±0.64,p0.01)、活性氧自由基(ROS)產(chǎn)生增多(220.36±40.95vs 117.66±16.27,p0.01)。與對(duì)照組比較,TNF-α組單核細(xì)胞粘附到內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量增多(554±111.45 vs110±13.45,p0.01)、細(xì)胞上清細(xì)胞間粘附分子-1(s ICAM-1)水平升高(56.97±8.12 pg/ml vs 12.23±4.43 pg/ml,p0.01)、上清血管細(xì)胞粘附分子-1(s VCAM-1)水平升高(150.13±22.30 pg/ml vs 17.56±9.08 pg/ml,p0.01),TNF-α組細(xì)胞ICAM-1 m RNA水平升高(12.31±2.01 vs 1.03±0.66,p0.01)、VCAM-1m RNA水平升高(25.74±4.54 vs 0.90±0.63,p0.01)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)m RNA水平升高(5.61±1.18 vs 0.97±0.21,p0.01)、白介素-8(IL-8)m RNA水平升高(3.39±0.53 vs 1.07±0.22,p0.01)、白介素-6(IL-6)m RNA水平升高(4.76±1.06 vs 1.00±0.49,p0.01)、白介素-1β(IL-1β)m RNA水平升高(3.00±0.45vs 1.00±0.45,p0.01)。TNF-α誘導(dǎo)血管內(nèi)皮損傷與p38絲裂原激活蛋白激酶(p38 MAPK)和核因子-κB(NF-κB)通路激活的關(guān)系:與對(duì)照組比較,TNF-α組細(xì)胞p-p38 MAPK表達(dá)增多(1.23±0.27 vs 0.29±0.12,p0.01)、下游磷酸化的原癌基因(p-c-jun)表達(dá)增多(0.85±0.15 vs 0.11±0.07,p0.01),磷酸化的κB抑制蛋白α(p-IκBα)表達(dá)增多(0.87±0.14 vs 0.28±0.17,p0.01)、磷酸化的IκBα激酶β(p-IKKβ)表達(dá)增多(0.61±0.13 vs 0.17±0.22,p0.05)、胞核NF-κB p65表達(dá)增多(1.32±0.24vs 0.69±0.16,p0.01),而胞漿NF-κB p65表達(dá)減少(0.39±0.17 vs 1.22±0.24,p0.01)。與TNF-α組相比,應(yīng)用p38 MAPK通路抑制劑(SB203580)后細(xì)胞ICAM-1蛋白表達(dá)減少(0.10±0.09 vs 0.95±0.17,p0.01)、VCAM-1蛋白表達(dá)減少(0.59±0.24 vs 2.56±0.35,p0.01)、IL-6 m RNA水平下降(2.66±0.74 vs5.24±0.96,p0.01)、IL-1βm RNA水平下降(1.47±0.69 vs 3.29±0.69,p0.01)、MCP-1 m RNA水平下降(2.33±0.83 vs 7.73±0.10,p0.01)、IL-8 m RNA水平下降(1.30±0.23 vs 3.94±0.72,p0.01),應(yīng)用NF-κB通路抑制劑(S2882)后細(xì)胞ICAM-1蛋白表達(dá)減少(0.12±0.11 vs 0.95±0.17,p0.01)、VCAM-1蛋白表達(dá)減少(0.08±0.09 vs 2.56±0.35,p0.01),IL-6 m RNA水平下降(1.81±0.76 vs5.24±0.96,p0.01)、IL-1βm RNA水平下降(1.19±0.66 vs 3.29±0.69,p0.01)、MCP-1 m RNA水平下降(1.85±1.23 vs 7.73±0.10,p0.01)、IL-8 m RNA水平下降(1.32±0.32 vs 3.94±0.72,p0.01)。高表達(dá)Sel S在TNF-α誘導(dǎo)血管內(nèi)皮損傷中的作用及其機(jī)制:與TNF-α+E-Vector組相比,TNF-α+pc-Sel S組細(xì)胞存活率升高[(81.76±1.47)(%)vs(51.37±11.30)(%),p0.01]、NO含量增多(1.71±0.31 mmol/ml vs 1.08±0.26mmol/ml,p0.01)、e NOS m RNA水平升高(0.81±0.10 vs 0.53±0.18,p0.05)、e NOS蛋白表達(dá)增多(1.30±0.22 vs 0.50±1.06,p0.01),而ET-1 m RNA水平下降(3.64±0.99 vs 6.65±1.05,p0.01)、ROS釋放減少(126.20±31.72 vs221.63±40.27,p0.01)。與TNF-α+E-Vector組相比,TNF-α+pc-Sel S組單核細(xì)胞粘附到內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量減少(297±105.87 vs 554±111.45,p0.01)、s ICAM-1水平下降(32.11±10.17 pg/ml vs 57.66±17.61 pg/ml,p0.01)、s VCAM-1水平下降(100.79±17.65 pg/ml vs 153.66±25.37 pg/ml,p0.01),細(xì)胞ICAM-1 m RNA水平下降(5.34±2.40 vs 12.31±2.42,p0.01)、VCAM-1 m RNA水平下降(14.60±4.61vs 26.41±4.56,p0.01)、IL-6 m RNA水平下降(2.14±0.60 vs 4.83±0.98,p0.01)、IL-1βm RNA水平下降(1.62±0.41 vs 2.98±0.42,p0.01)、MCP-1 m RNA水平下降(2.18±0.75 vs 5.62±1.08,p0.01)、IL-8 m RNA水平下降(1.34±0.50 vs3.27±0.82,p0.01),細(xì)胞p-p38 MAPK表達(dá)減少(0.59±0.17 vs 3.27±0.82,p0.01)、p-c-jun表達(dá)減少(0.33±0.11 vs 0.86±0.15,p0.01)、p-IKKβ表達(dá)減少(0.10±0.01 vs 0.61±0.13,p0.01)、p-IκBα表達(dá)減少(0.42±0.11 vs 0.87±0.14,p0.01)、胞核NF-κB p65表達(dá)減少(0.38±0.20 vs 1.17±0.18,p0.01),而細(xì)胞胞漿NF-κB p65表達(dá)增加(0.90±0.12 vs 0.25±0.15,p0.01)。低表達(dá)Sel S在TNF-α誘導(dǎo)血管內(nèi)皮損傷中的作用及其機(jī)制:與TNF-α+Neg.RNA組相比,TNF-α+Sel S si RNA組細(xì)胞存活率降低[(26.57±7.62)(%)vs(52.27±13.17)(%),p0.01]、NO含量降低(0.46±0.15 mmol/ml vs1.02±0.23 mmol/ml,p0.01)、e NOS m RNA水平下降(0.18±0.12 vs 0.52±0.15,p0.01)、e NOS蛋白表達(dá)減少(0.08±0.07 vs 0.63±0.22,p0.01),而ET-1 m RNA水平升高(9.35±1.03 vs 6.73±1.30,p0.01)、ROS釋放增多(352.20±31.82 vs211.84±41.46,p0.01)。與TNF-α+Neg.RNA組相比,TNF-α+Sel S si RNA組單核細(xì)胞粘附到內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量增多(1371±98.51 vs 554±102.69,p0.01)、s ICAM-1水平升高(93.10±10.14 pg/ml vs 60.52±10.51 pg/ml,p0.01)、s VCAM-1水平升高(276.73±20.06 pg/ml vs 164.00±18.62 pg/ml,p0.01),細(xì)胞ICAM-1 m RNA水平升高(25.75±5.49 vs 12.43±4.73,p0.01)、VCAM-1 m RNA水平升高(46.33±5.93 vs 25.42±7.74,p0.01)、IL-6 m RNA水平升高(8.71±1.44 vs4.92±0.93,p0.01)、IL-1βm RNA水平升高(6.26±0.87 vs 3.10±1.03,p0.01)、MCP-1 m RNA水平升高(9.14±1.35 vs 5.32±1.57,p0.01)、IL-8 m RNA水平升高(5.25±1.21 vs 3.03±0.80,p0.01),細(xì)胞p-p38 MAPK表達(dá)增多(1.87±0.23 vs1.14±0.35,p0.01)、p-c-jun表達(dá)增多(1.76±0.18 vs 1.15±0.30,p0.01)、p-IKKβ表達(dá)增多(0.68±0.09 vs 0.20±0.05,p0.01)、p-IκBα表達(dá)增多(1.20±0.27 vs0.82±0.08,p0.05)、胞核NF-κB p65表達(dá)增多(1.42±0.17 vs 0.78±0.22,p0.01),而細(xì)胞胞漿NF-κB p65表達(dá)減少(0.08±0.04 vs 0.63±0.20,p0.01)。結(jié)論:HFD喂養(yǎng)的LDLR KO小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化病變區(qū)Sel S表達(dá)增加,說明Sel S可能參與AS的反應(yīng)進(jìn)程。TNF-α引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂并激活p38 MAPK和NF-κB信號(hào)通路,應(yīng)用p38 MAPK通路抑制劑和NF-κB通路抑制劑后減輕TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷,說明TNF-α通過激活p38 MAPK和NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂。高表達(dá)Sel S抑制TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷及p38 MAPK和NF-κB通路激活,低表達(dá)Sel S促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷及p38 MAPK和NF-κB通路激活,說明Sel S在TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷中發(fā)揮保護(hù)作用并且與其影響p38 MAPK和NF-κB信號(hào)通路的激活相關(guān)。Sel S可能成為防治血管內(nèi)皮損傷研究的新靶點(diǎn),尤其在以炎癥反應(yīng)貫穿始終、以內(nèi)皮損傷為關(guān)鍵環(huán)節(jié)的AS中得以體現(xiàn)。
【圖文】：

而 HFD 組 LDLR KO 小鼠主動(dòng)脈可見其斑塊明顯地朝向內(nèi)膜凸起，斑塊的纖維帽下可見大量壞死物質(zhì)，斑塊處中膜平滑肌也因受壓而萎縮（圖 1）。圖1 各組LDLR KO小鼠主動(dòng)脈H&E染色情況RCD：普通飲食；HFD：高脂飲食。

2. 高脂喂養(yǎng)的LDLR KO小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化病變區(qū)炎性指標(biāo)表達(dá)升高HFD 組 LDLR KO 小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化病變區(qū) F4/80 表達(dá)（0.11±0.01）較RCD組（0.06±0.01）明顯升高（p＜0.001，圖2A及圖2B）。與RCD組（0.003±0.003）相比，HFD組LDLR KO小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化病變區(qū)TNFR-1表達(dá)（0.010±0.004）顯著增加（p＜0.01，圖 2C 及圖 2D），同時(shí)在 HFD 組 LDLR KO 小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化病變區(qū) p-NF-κB p65 表達(dá)（0.010±0.004）較 RCD 組（0.003±0.002）表達(dá)上調(diào)（p＜0.01，，圖 2E 及圖 2F）。圖2 各組LDLR KO小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化病變區(qū)炎性指標(biāo)表達(dá)A：在RCD組和HFD組中LDLR KO小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化病變區(qū)F4/80表達(dá)；B：Image Pro Plus
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R543.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Catherine M Greene;Noel G McElvaney;;Z α-1 antitrypsin deficiency and the endoplasmic reticulum stress response[J];World Journal of Gastrointestinal Pharmacology and Therapeutics;2010年05期

2 杜建玲;安利佳;孫長(zhǎng)凱;門莉莉;張秀娟;李昌臣;;SelS高表達(dá)保護(hù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞免于H_2O_2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2007年04期

本文編號(hào)：2647338