【摘要】：研究背景心肌缺血性疾病是當(dāng)今危害人類健康的主要疾病之一,人們通過(guò)溶栓、經(jīng)皮冠脈血管成形術(shù)、冠脈搭橋術(shù)等手段使缺血心肌在短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)血供,改善心功能,但仍然不能避免缺血再灌注時(shí)組織損傷反而加重,甚至導(dǎo)致不可逆性的功能和器質(zhì)性損傷的發(fā)生~1。心肌缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,IR)的發(fā)生機(jī)制目前認(rèn)為與自由基的作用、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、白細(xì)胞的激活、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及線粒體功能障礙等有關(guān),其中自由基活性氧分子(reactive oxygen species,ROS)損傷作用和線粒體功能障礙被認(rèn)為是缺血再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)2-3。自噬(Autophagy)是生物在進(jìn)化過(guò)程中保留的一種特殊現(xiàn)象,是細(xì)胞在生存、發(fā)育、分化及代謝過(guò)程中的一種溶酶體降解途徑,對(duì)物質(zhì)及能量進(jìn)行更新,來(lái)維持細(xì)胞功能和活性~(4-5)。缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)在缺氧狀態(tài)下能被充分激活,HIF-1α是其活性亞基,能夠穩(wěn)定結(jié)合在靶基因低氧反應(yīng)元件上的特異性蛋白,通過(guò)快速有效的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,參與穩(wěn)定細(xì)胞形態(tài)、血管形成以及鐵、糖代謝和細(xì)胞生長(zhǎng)增殖而產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng),尤其對(duì)于需氧量大的心肌細(xì)胞具有重要的保護(hù)作用~6。通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞普遍處于缺氧狀態(tài),線粒體產(chǎn)生大量的ROS,ROS能夠抑制HIF-1的降解,穩(wěn)定HIF-1的活性~7。HIF-1α能夠活化BNIP-3和NIX,活化的BNIP-3和NIX與Bcl-2結(jié)合,釋放Beclin-1誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生,自噬和低氧相關(guān)分子信號(hào)通路不是單獨(dú)存在,而是相互關(guān)聯(lián)的~8。心肌細(xì)胞通過(guò)自噬應(yīng)對(duì)不良刺激,在心肌缺血階段,自噬可以通過(guò)溶酶體降解受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器為細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及能量來(lái)進(jìn)行代償;心肌缺血再灌注階段,心肌細(xì)胞內(nèi)ROS增加,ROS的積累可以使HIF-1α蛋白穩(wěn)定存在,進(jìn)一步通過(guò)Beclin-1途經(jīng)誘導(dǎo)自噬,自噬可能通過(guò)清除被ROS損傷的細(xì)胞器和蛋白質(zhì),降低ROS對(duì)細(xì)胞的毒性傷害,保護(hù)細(xì)胞,還可能降解正常蛋白質(zhì)和細(xì)胞器,導(dǎo)致細(xì)胞損傷,甚至自噬性死亡~(9-10)。HIF-1α和自噬在心肌缺血再灌注損傷中表達(dá)及作用的研究已經(jīng)越來(lái)越深入,但二者之間關(guān)系的研究較少。楊f痰熱死錳逋庋跆前崮Ｐ凸鄄炷勻毖毖踔蠬IF-1α對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞自噬具有調(diào)節(jié)作用,HIF-1α表達(dá)量逐漸增加,自噬增加,并誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的死亡,阻斷HIF-1α的表達(dá),小膠質(zhì)細(xì)胞自噬減少,死亡率降低~(11)。研究目的建立大鼠心肌缺血再灌注損傷模型,觀察缺血再灌注時(shí)自噬活性、HIF-1α蛋白表達(dá)情況;調(diào)節(jié)自噬強(qiáng)度,觀察HIF-1α蛋白表達(dá)和心肌損傷情況;調(diào)節(jié)HIF-1α蛋白表達(dá),觀察自噬發(fā)生和心肌損傷情況,借此探討心肌缺血再灌注損傷時(shí)HIF-1α和自噬之間可能的關(guān)系,以及對(duì)心肌細(xì)胞功能可能產(chǎn)生的影響,為臨床治療心肌缺血性疾病提供可能的理論基礎(chǔ)。研究方法和結(jié)果一、大鼠心肌缺血再灌注損傷模型的制備與驗(yàn)證1、大鼠心肌缺血再灌注損傷模型的建立選擇健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠,術(shù)前禁食12h,不禁水,10%水合氯醛30mg/100g腹腔注射麻醉,仰臥位固定,經(jīng)口插管,呼吸機(jī)輔助呼吸。胸骨下段切口進(jìn)胸,在心臟左心耳根部l~2 mm處,尋找辨認(rèn)左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD),以雙頭6-0無(wú)損傷縫線帶3mm×3mm滌綸墊片,在LAD下方水平褥式縫合,再穿同樣大小墊片,雙結(jié)結(jié)扎擠壓墊片阻斷冠脈血流,每個(gè)線結(jié)下置10號(hào)粗絲線產(chǎn)生活結(jié)作用,靠緩慢拉鋸式牽拉絲線松解線結(jié),恢復(fù)血流灌注~(12-14)。2、大鼠心肌缺血再灌注損傷模型的驗(yàn)證將200-300g健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組,每組10只,按照上述方法建立動(dòng)物模型,各實(shí)驗(yàn)組大鼠存活6-8只,死亡率28%,每組最終選取6只存活大鼠相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)照組(a組),即假手術(shù)組:開胸后僅于心肌表面穿過(guò)縫線,不結(jié)扎LAD,觀察120min取全血及切取左心室心肌組織;單純?nèi)毖M(b組):結(jié)扎LAD,不松結(jié)扎線,觀察30min取全血及切取左心室心肌組織;再灌注60min組(c組):結(jié)扎LAD30min,松開結(jié)扎線,恢復(fù)灌注60min取全血及切取左心室心肌組織;再灌注120min組(d組):結(jié)扎LAD30min,松結(jié)扎線,恢復(fù)灌注120min取全血及切取左心室心肌組織;再灌注180min組(e組):結(jié)扎LAD30min,松結(jié)扎線,恢復(fù)灌注180min取全血及切取左心室心肌組織。采用ELISA試劑盒測(cè)定血清cTnT含量,TTC、伊文氏藍(lán)雙染色估算心肌缺血和梗死面積,多通道生理記錄儀監(jiān)測(cè)心肌力學(xué)指標(biāo)評(píng)價(jià)心肌收縮功能。結(jié)果:大鼠心肌缺血再灌注后血清cTnT含量、心肌缺血及梗死面積增加,心肌收縮功能進(jìn)一步降低,再灌注120min時(shí)功能損傷最明顯,再灌注180分鐘時(shí)有所恢復(fù)。二、大鼠心肌缺血再灌注損傷時(shí)HIF-1α蛋白表達(dá)及自噬發(fā)生情況將200-300g健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組,每組選取6只存活大鼠相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,手術(shù)操作同第一部分。對(duì)照組(A組),即假手術(shù)組:開胸后僅于心肌表面穿過(guò)縫線,不結(jié)扎LAD,觀察120min取全血及切取左心室心肌組織;單純?nèi)毖M(B組):結(jié)扎LAD,觀察30min取全血及切取左心室心肌組織;缺血再灌注組(C組):結(jié)扎LAD脈30min,松開結(jié)扎線,觀察120分鐘取全血及切取左心室心肌組織。采用western-blot方法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞HIF-1α蛋白和自噬相關(guān)蛋白Beclin-1的表達(dá)量,以LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值表示自噬發(fā)生強(qiáng)度;RT-PCR方法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞HIF-1αmRNA和Beclin-1 mRNA表達(dá)量。結(jié)果:單純?nèi)毖M心肌細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1和HIF-1α蛋白表達(dá)高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。缺血再灌注組心肌細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1和HIF-1α蛋白表達(dá)均較單純?nèi)毖M進(jìn)一步增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Pearson相關(guān)性分析檢驗(yàn)缺血再灌注組心肌細(xì)胞HIF-1α和Beclin-1蛋白表達(dá)具有相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)為0.730,P=0.000。缺血再灌注組心肌細(xì)胞Beclin-1和HIF-1αmRNA表達(dá)均高于單純?nèi)毖M,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Pearson相關(guān)性分析檢驗(yàn)缺血再灌注組心肌細(xì)胞HIF-1αmRNA和Beclin-1 mRNA表達(dá)具有相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)為0.630,P=0.005。三、抑制自噬,大鼠心肌缺血再灌注損傷時(shí)HIF-1α蛋白表達(dá)及心肌損傷情況將200-300g健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組,對(duì)照組、缺血再灌注組和自噬抑制組,每組選取6只存活大鼠相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,手術(shù)操作同第一部分。自噬抑制組動(dòng)物在手術(shù)前腹腔注射自噬抑制劑6-氨基-3-甲基嘌呤(3-MA),15mg/kg,每天一次,連續(xù)3天。對(duì)照組和缺血再灌注組大鼠腹腔注射同等體積的生理鹽水,每天一次,連續(xù)3天。對(duì)照組(D組),即假手術(shù)組:開胸后僅于心肌表面穿過(guò)縫線,不結(jié)扎LAD,觀察120min取全血及切取左心室心肌組織;缺血再灌注組(E組):結(jié)扎LAD30min,松開結(jié)扎線,觀察120分鐘取全血及切取左心室心肌組織;自噬抑制組(F組):結(jié)扎LAD30min,松開結(jié)扎線,觀察120分鐘取全血及切取左室心肌組織。采用western-blot方法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞HIF-1α蛋白和自噬相關(guān)蛋白Beclin-1的表達(dá)量,以LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值表示自噬發(fā)生強(qiáng)度;采用RT-PCR方法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞HIF-1αmRNA和Beclin-1 mRNA表達(dá)量;通過(guò)測(cè)定血清cTnT含量,TTC、伊文氏藍(lán)雙染色估算心肌缺血和梗死面積及心肌力學(xué)指標(biāo)變化評(píng)價(jià)心肌損傷程度。結(jié)果:缺血再灌注組心肌細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1蛋白表達(dá)高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。自噬抑制組心肌細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1蛋白表達(dá)均較缺血再灌注組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而Beclin-1 mRNA表達(dá)量與缺血再灌注組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。自噬抑制組心肌HIF-1α蛋白和HIF-1αmRNA表達(dá)量與缺血再灌注組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。自噬抑制組血清cTnT含量、心肌缺血和梗死面積均明顯低于缺血再灌注組,心肌力學(xué)指標(biāo)也優(yōu)于缺血再灌注組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。四、抑制HIF-1α蛋白表達(dá),大鼠心肌缺血再灌注損傷時(shí)自噬發(fā)生及心肌損傷情況將200-250g健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組,對(duì)照組、缺血再灌注組和HIF-1α蛋白抑制組,每組10只,最終選取6只存活大鼠相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所有手術(shù)操作均同第一部分。HIF-1α蛋白抑制組動(dòng)物在手術(shù)前30分鐘腹腔注射HIF-1α蛋白抑制劑3-(5,-羥甲基-2,呋喃基)-1-苯甲基吲唑(YC-1),終濃度為5μM,用量20mg/kg,對(duì)照組、缺血再灌注組大鼠手術(shù)前30分鐘腹腔注射同等體積的生理鹽水。對(duì)照組,即假手術(shù)組(Ⅰ組):開胸后僅于心肌表面穿過(guò)縫線,不結(jié)扎LAD,觀察120min取全血及切取左心室心肌組織;缺血再灌注組(Ⅱ組):結(jié)扎LAD30min,松開結(jié)扎線,觀察120分鐘取全血及切取左心室心肌組織;HIF-1α蛋白抑制組(Ⅲ組):結(jié)扎LAD30min,松開結(jié)扎線,觀察120分鐘取全血及切取左心室心肌組織。采用western-blot方法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞HIF-1α蛋白和自噬相關(guān)蛋白Beclin-1的表達(dá)量,以LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值表示自噬發(fā)生強(qiáng)度;采用RT-PCR方法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞HIF-1αmRNA和Beclin-1 mRNA表達(dá)量;通過(guò)測(cè)定血清cTnT含量,TTC、伊文氏藍(lán)雙染色估算心肌缺血和梗死面積及心肌力學(xué)指標(biāo)變化評(píng)估心肌損傷程度。結(jié)果:缺血再灌注組心肌細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)量高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。HIF-1α蛋白抑制組心肌細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)量較缺血再灌注組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而HIF-1αmRNA表達(dá)量與缺血再灌注組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。HIF-1α抑制組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1蛋白低于缺血再灌注組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)而Beclin-1 mRNA表達(dá)量與缺血再灌注組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。HIF-1α抑制組相對(duì)心肌梗死面積高于缺血再灌注組,cTnT含量增加,心肌收縮功能減低,而心肌缺血面積卻低于缺血再灌注組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:一、應(yīng)用帶墊片活結(jié)結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支,阻斷30min,恢復(fù)灌注60-180min,再灌注120min時(shí)損傷效果最佳,手術(shù)操作簡(jiǎn)便,死亡率較低,可以成功制作大鼠心肌缺血再灌注損傷模型。二、大鼠在心肌缺血再灌注損傷時(shí)自噬標(biāo)志蛋白LC3顯著增加,自噬增強(qiáng),自噬相關(guān)蛋白Beclin-1及Beclin-1mRNA表達(dá)增加,自噬可能是依賴Beclin-1途徑產(chǎn)生的。HIF-1α蛋白和HIF-1αmRNA表達(dá)明顯增加,與Beclin-1在蛋白和基因水平上均顯著正相關(guān),HIF-1α作為缺氧應(yīng)激反應(yīng)中的中樞調(diào)控因子,可能通過(guò)Beclin-1途經(jīng)對(duì)自噬產(chǎn)生一定的調(diào)節(jié)作用。三、應(yīng)用腹腔注射自噬抑制3-MA,可以在蛋白水平有效抑制大鼠心肌缺血再灌注損傷時(shí)的自噬強(qiáng)度,心肌損害減輕,心肌缺血及梗死面積降低。自噬在心肌缺血再灌注損傷時(shí)對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生了不利影響,抑制自噬可以對(duì)心臟功能起到一定的保護(hù)作用。大鼠心肌缺血再灌注損傷HIF-1α蛋白和HIF-1αmRNA表達(dá)在自噬水平有效抑制時(shí)無(wú)明顯變化,自噬強(qiáng)度不影響HIF-1α蛋白和基因表達(dá)。四、腹腔注射HIF-1α抑制劑YC-1后HIF-1α表達(dá)在蛋白水平被有效抑制,自噬強(qiáng)度減低,HIF-1α對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷中的自噬可能產(chǎn)生一定的調(diào)節(jié)作用。HIF-1α在大鼠心肌缺血再灌注損傷中對(duì)心肌細(xì)胞功能影響具有兩面性。一方面,抑制大鼠心肌缺血再灌注損傷HIF-1α蛋白表達(dá),大鼠心肌梗死面積增加,心肌細(xì)胞收縮功能降低,心肌損傷加重,HIF-1α可以促進(jìn)心肌細(xì)胞缺血缺氧條件下的活性,不依賴自噬途經(jīng)對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生有利的影響;另一方面,HIF-1α參與誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生,依賴自噬途經(jīng)對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生不利影響,抑制大鼠心肌缺血再灌注損傷HIF-1α蛋白表達(dá)可以降低缺血區(qū)自噬強(qiáng)度,減少缺血區(qū)心肌細(xì)胞自噬性損傷,降低心肌缺血面積,對(duì)缺血區(qū)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。
【圖文】：

持續(xù)觀察180min。(5)22G套管針穿刺上腔靜脈，靜脈置管便于實(shí)驗(yàn)取血及補(bǔ)液。圖1 大鼠心肌缺血再灌注損傷模型的制作1.1.6 大鼠心肌缺血再灌注損傷模型的驗(yàn)證(1)建立大鼠心肌缺血再灌注損傷模型分組：健康雄性SD大鼠，隨機(jī)分成5組，每組10只大鼠。對(duì)照組（a組），即假手術(shù)組：開胸后僅于心肌表面穿過(guò)縫線，，不結(jié)扎LAD，觀察120min取全血及切取左心室心肌組織；單純?nèi)毖M（b組）：結(jié)扎LAD，不松結(jié)扎線，觀察30min取全血及切取左心室心肌組織；再灌注60min組（c組）：結(jié)扎LAD30min，松開結(jié)扎線，恢復(fù)灌注60min取全血及切取左心室心肌組織；再灌注120min組（d組）：結(jié)扎LAD30min，松結(jié)扎線，恢復(fù)灌注120min取全血?

天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文 第一部分 大鼠心肌缺血再灌注損傷模型的制備與驗(yàn)1.2.1 大鼠心電圖變化結(jié)扎LAD3-5minⅡ?qū)?lián)心電圖ST段抬高，表現(xiàn)為弓背向上，T波高尖，也見到寬大變形的QRS波，放松結(jié)扎線后10-15min，寬大變形的QRS波縮窄，S段回落超過(guò)一半以上（見圖2）。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R542.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 肖楊;吳青青;昌薇;唐其柱;;自噬在結(jié)構(gòu)性心臟疾病中的作用及機(jī)制[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2017年33期

2 余鵬;洪葵;;線粒體自噬及其在心臟疾病中的研究進(jìn)展[J];中華心血管病雜志;2017年03期

3 余惠珍;高潔;鄭熙;朱鵬立;;冠脈結(jié)扎法在大鼠急性心肌梗死模型制作中的應(yīng)用[J];中國(guó)心血管病研究;2016年08期

4 劉艷;李玲萍;張紅霞;張煒?lè)?王麗月;薛晉紅;賀忠梅;;HIF-1α穩(wěn)定表達(dá)抑制缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡的作用研究[J];中國(guó)心血管病研究;2016年03期

5 王友;朱蘇紅;劉秀華;;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬的研究進(jìn)展[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2015年06期

6 唐中園;張寧;狄文;李衛(wèi)平;;缺氧誘導(dǎo)因子-1α對(duì)低氧誘導(dǎo)自噬的調(diào)控作用[J];上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2015年12期

7 許榮;王寧;王曉明;;自噬在心肌缺血再灌注損傷中的研究進(jìn)展[J];中華老年心腦血管病雜志;2015年12期

8 孟凡娜;董艷紅;;腦缺血后自噬調(diào)控的信號(hào)通路[J];國(guó)際腦血管病雜志;2015年09期

9 高康;賈舒婷;羅瑛;;缺氧應(yīng)激反應(yīng)中活性氧與缺氧誘導(dǎo)因子-1的相互作用[J];醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志;2015年03期

10 池瑞芳;田晶;李保;秦富忠;;心肌細(xì)胞自噬在心室重構(gòu)中的作用[J];中華心血管病雜志;2015年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 楊f

本文編號(hào)：2645199