【摘要】：研究背景:動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病和卒中的主要原因,其基本病理特征是炎癥反應(yīng)、氧化修飾和脂質(zhì)沉積。單核/巨噬細(xì)胞在動脈粥樣硬化復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制中具有顯著的活性,通過黏附分子、趨化因子、腫瘤壞死因子等炎癥因子激活、招募進(jìn)入AS斑塊,加速AS的病理進(jìn)程。趨化因子是免疫監(jiān)視和炎癥過程中白細(xì)胞轉(zhuǎn)運的重要調(diào)節(jié)因子。影響初始炎癥應(yīng)答的因素如自由基的產(chǎn)生、NF-κB通路的激活、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的釋放以及補體的激活等可能直接或間接的誘導(dǎo)趨化因子的合成。趨化因子CCL20及其受體CCR6由于特異的配對關(guān)系,因此被稱作CCL20-CCR6軸,目前認(rèn)為該趨化因子軸主要通過作用單核細(xì)胞,介導(dǎo)其離開骨髓并募集至血管壁而調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化進(jìn)程。炎癥因子IL-17目前被認(rèn)為主要由Th17細(xì)胞分泌且主要受CCL20-CCR6軸調(diào)控。然而,CCL20和IL-17在巨噬細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制尚無闡述,在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者中的表達(dá)及與冠心病的關(guān)系亦鮮有有報道。研究目的:以小鼠RAW264.7細(xì)胞和中國冠心病患者為研究對象,探討CCL20及IL-17在巨噬細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制及其與冠心病之間的關(guān)系。研究方法:第一部分:1.oxLDL以不同作用濃度和時間誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞建立模型,檢測CCL20及IL-17表達(dá)水平;2.阿托伐他汀干預(yù)oxLDL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞模型并檢測CCL20及IL-17表達(dá)水平;第二部分:1.在oxLDL誘導(dǎo)模型和阿托伐他汀干預(yù)模型中特異性抑制NF-κB活性,檢測CCL20及IL-17表達(dá)水平;2.構(gòu)建CCL20過表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞使CCL20過表達(dá),檢測NF-κB活性及對IL-17的分泌的影響;3.采用AKT特異性抑制劑和激動劑干預(yù)RAW264.7細(xì)胞,檢測下游NF-κB活性及CCL20、IL-17的表達(dá);第三部分:1.入選急性心肌梗死、穩(wěn)定性心絞痛、冠脈造影正常共206例患者,ELISA 檢測血清 CCL20 及 IL-17 濃度,RT-PCR 檢測 PBMCs 中 CCR6 mRNA 水平;2.分析血清CCL20及IL-17濃度、CCR6 mRNA水平與冠脈狹窄嚴(yán)重程度關(guān)系及在冠心病中的診斷價值,logistic回歸分析冠心病危險因素。研究結(jié)果:1.oxLDL刺激RAW264.7可誘導(dǎo)CCL20的mRNA、蛋白水平上調(diào)及IL-17的分泌增加,且與oxLDL刺激呈濃度及時間依賴性;2.阿托伐他汀可使oxLDL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中CCL20、IL-17的表達(dá)減少,且呈濃度依賴性;3.NF-κB通路參與CCL20及IL-17的調(diào)控;4.RAW264.7細(xì)胞CCL20過表達(dá)亦可激活NF-κB活性,且調(diào)控IL-17分泌;5.AKT可能作為NF-κB信號通路的上游調(diào)節(jié)CCL20及IL-17的表達(dá);6.急性心肌梗死及穩(wěn)定性心絞痛患者血漿CCL20、IL-17水平及PBMCs中CCR6 mRNA水平較冠脈造影正�；颊呙黠@升高;CCL20、CCR6、IL-17三者呈正相關(guān),且與冠脈狹窄嚴(yán)重程度密切相關(guān);血漿CCL20、IL-17濃度在冠心病中具有良好的診斷價值;血漿CCL20、IL-17濃度水平是冠心病獨立相關(guān)因素�？偨Y(jié):1.AKT/NF-κB/CCL20/IL-17信號通路可能是巨噬細(xì)胞參與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的重要信號通路;2.oxLDL及阿托伐他汀能干預(yù)RAW264.7細(xì)胞中AKT/NF-κB信號通路的活性,并調(diào)控CCL20及IL-17的表達(dá);3.CCL20過表達(dá)亦可反饋性增強NF-κB活性,進(jìn)一步增強CCL20的促動脈粥樣硬化作用;4.CCL20、IL-17濃度與冠脈狹窄嚴(yán)重程度密切相關(guān),在冠心病診斷中具有一定價值;5.CCL20、IL-17是冠心病新的獨立相關(guān)因素。
【圖文】：

逑分別使ＣＣＬ２０ｍＲＮＡ上調(diào)３．７倍、５．０倍，差異均有顯著性（Ｆ＝３５８．１８，邋Ｐ＜０．００１，逡逑見圖１－１）。ＷＢ結(jié)果顯示ｏｘＬＤＬ可誘導(dǎo)ＲＡＷ２６４．７細(xì)胞中ＣＣＬ２０蛋白的表達(dá)上逡逑調(diào)，且呈濃度依賴性；與Ｏｕｇ／ｍｌ組相比，２０ｕｇ／ｍｌ、４０ｕｇ／ｍｌ的ｏｘＬＤＬ誘導(dǎo)組分逡逑別使ＣＣＬ２０蛋白上調(diào)４．３倍、５．８倍，差異具有顯著性（Ｆ＝８６．２６，邋Ｐ０．００１，見逡逑圖１－２）。ＥＬＩＳＡ結(jié)果顯示ｏｘＬＤＬ可誘導(dǎo)ＲＡＷ２６４．７細(xì)胞分泌ＣＣＬ２０及ＩＬ－１７增逡逑加，呈濃度依賴性（見圖１－３、１－４，表１－１）。逡逑％邐１５０－１逡逑２逡逑Ｃ邐＊逡逑．２邐１００－邐ＭＭ，逡逑ｍ邐＊逡逑ｉ邐邐逡逑ｓ邐ｎ逡逑Ｏ邐ｉｃ邐＝＝＝：：：：：逡逑ｇ邋５０－邐

圖２－１邋ｐＣＤＮＡ３．１（＋）載體圖譜逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１邋Ｔｈｅ邋ａｔｌａｓ邋ｏｆ邋ｐＣＤＮＡ３．１（＋）邋ｖｅｃｔｏｒ逡逑的基因ＣＤＳ區(qū)域設(shè)計合成逡逑過ＮＣＢＩ查找目的基因的ｍＲＮＡ序列，針對ＣＤＳ區(qū)域以及選用酶切位點。Ｍｏｕｓｅ邋ＣＣＬ２０基因ＣＤＳ區(qū)域全長２９３ｂｐ，根據(jù)載體點為上游ＥｃｏＲ邋Ｉ、下游ＢａｍＨ邋Ｉ。將含有酶切位點的目的基因ＣＤ金唯智基因公司合成。引物序列如下，下劃線為酶切位點。逡逑－Ｆ：邋５＇邋－ＧＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＣＴＧＣＧＧＴＧＧＣＡＡＧＣＧ－３＇邐（Ｅｃｏ－Ｒ：邋５＇－ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＧＡＣＴＣＴＴＡＧＧＣＴＧ－３＇邐（Ｂａｍ成基因測序鑒定逡逑合成好的核心質(zhì)粒送往上海美吉生物有限公司ＤＮＡ測序，測－Ｆ／Ｒ。將測序所得結(jié)果與ＮＣＢＩ中ＣＣＬ２０序列進(jìn)行比對，，比對
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R541.4

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 王偉;張旗;龐艷梅;邸書華;甄利波;;趨化因子在動脈粥樣硬化中的作用機(jī)制[J];臨床薈萃;2009年11期

2 Seon Hee Chang;;A novel heterodimeric cytokine consisting of IL-17 and IL-17F regulates inflammatory responses[J];Cell Research;2007年05期

本文編號：2644023