【摘要】：研究目的:該實(shí)驗(yàn)使用C57BL/6J背景的野生型(wild-type,WT)小鼠和白介素-12p35基因敲除(interleukin-12p35 knockout,IL-12p35-KO)小鼠復(fù)制血管緊張素II(angiotensin II,Angll)所致的高血壓心肌肥厚模型,研究心肌肥厚發(fā)生和發(fā)展過程中IL-12p35的表達(dá)情況,探討IL-12p35基因缺失對(duì)心肌肥厚過程中的炎癥和自噬調(diào)節(jié)作用,為臨床治療高血壓所致心肌肥厚提供新的治療靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)方法:1.實(shí)驗(yàn)分組:10-12周雄性野生型C57BL/6J 16只,隨機(jī)分成2組,每組8只,A組:陰性對(duì)照組,B組:陽(yáng)性對(duì)照組;10-12周IL-12p35-KO雄性小鼠(C57BL/6J背景)16只,隨機(jī)分成2組,每組8只,C組:實(shí)驗(yàn)組D組:條件對(duì)照組。2.血壓監(jiān)測(cè):使用小動(dòng)物血壓測(cè)量?jī)x(BP-98A,Softron,Japan)進(jìn)行尾動(dòng)脈測(cè)量血壓和心率。3.心臟超聲:使用小動(dòng)物超聲儀(Visual Sonics Vevo2100)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。4.心肌肥厚的檢測(cè):Real-time PCR檢測(cè)心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、腦鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)、I型膠原蛋白(Collagen I)的表達(dá)。5.心肌體重指數(shù):心肌質(zhì)量/體重(Heart weight/Body weight,HW/BW)觀察心肌肥厚情況。6.心肌纖維化:使用Masson三色特殊染色法檢測(cè)心肌組織纖維化程度。7.心肌炎癥浸潤(rùn):使用蘇木精和伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色觀察炎癥的浸潤(rùn)情況,免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)CD3、CD68的表達(dá)。8.自噬的檢測(cè):使用蛋白免疫印記(Western Blot,WB)和免疫組化化學(xué)染色檢測(cè)微管相關(guān)蛋白-1輕鏈3(Microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)、p62的表達(dá)。9.心肌肥厚IL-12p35的表達(dá):Real-time PCR檢測(cè)IL-12p35。10.信號(hào)通路:使用WB檢測(cè)JAK2/STAT4(signal transducers and activators of transcription)通道磷酸化情況,進(jìn)行下游通路機(jī)制的研究。11.統(tǒng)計(jì):使用SPSS18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析,所有數(shù)據(jù)都以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,2組間的比較采用t檢驗(yàn),多組之間比較采用one-way ANOVA,P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.01為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P0.001為有極其顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:在AngⅡ灌注前4組的基礎(chǔ)血壓沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,AngⅡ灌注后3天血壓開始升高,在第3周達(dá)到峰值,持續(xù)至第4周,并且心臟超聲和心肌肥厚標(biāo)志物:ANP、BNP、Collagen I mRNA的檢測(cè)表明高血壓心肌肥厚建模成功,其中IL-12p35-KO+AngⅡ組收縮壓(systolic blood pressure,SBP)、HW/BW較WT+AngⅡ組明顯升高,并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HE、Masson染色反映了AngⅡ微量滲透泵持續(xù)灌注的小鼠,心肌纖維化、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯、心肌細(xì)胞肥大、排列紊亂,肌纖維斷裂,細(xì)胞核畸形、空泡樣變較顯著,其中IL-12p35-KO+AngⅡ組較WT+AngⅡ組明顯,并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。持續(xù)的AngⅡ微量滲透泵灌注增加了CD3、CD68的表達(dá)。IL-12p35基因的缺失使自噬反應(yīng)增強(qiáng),并且促進(jìn)了JAK2/STAT4信號(hào)通路的磷酸化,而AngⅡ微量滲透泵灌注加重了自噬反應(yīng)和JAK2/STAT4信號(hào)通路的磷酸化。經(jīng)過AngⅡ微量滲透泵灌注后的小鼠,WT+AngⅡ組小鼠心肌組織中IL-12p35mRNA表達(dá)較WT組明顯升高。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:通過AngⅡ微量滲透泵灌注建立了高血壓心肌肥厚小鼠模型,研究表明IL-12p35基因的缺失可以促使血壓更高,增大HW/BW,加重炎癥浸潤(rùn)、心肌細(xì)胞肥大、排列紊亂、肌纖維斷裂、細(xì)胞核畸形、空泡樣變和自噬水平,同時(shí)也可以激活JAK2/STAT4信號(hào)通路的磷酸化,并且WT+AngⅡ組小鼠心肌組織中IL-12p35mRNA表達(dá)較WT組明顯升高。說明IL-12p35基因不僅參與了AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓心肌肥厚的病理過程,而且還具有抑制炎癥和調(diào)控自噬的效應(yīng),并且這些生物學(xué)效應(yīng)可能是由JAK2/STAT4信號(hào)通路介導(dǎo)的。由此可見IL-12p35可能成為防治高血壓所致心肌肥厚的新靶點(diǎn)。
【圖文】：

微量滲透泵植入皮下之前對(duì)各組小鼠基礎(chǔ)血壓水平的測(cè)量數(shù)據(jù)顯示各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在 AngII 灌注后第 3 天小鼠 SBP 就有了明顯的升高，并且維持高血壓狀態(tài)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。其中 WT 組 vs.p35-KO 組 P>0.05 無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；WT 組 vs.WT+AngII 組，p35-KO 組 vs.p35-KO+AngII 組有極其顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，*P<0.001;WT+AngII 組 vs.p35-KO+AngII 組在微量滲透泵灌注 1 周內(nèi)血壓與基礎(chǔ)值相比都有明顯升高，但是血壓升高幅度沒有明顯差異，1 周后測(cè)量收縮壓數(shù)據(jù)顯示 p35-KO+AngII 組較 WT+AngII 組血壓仍在繼續(xù)升高并且在第 3 周達(dá)到最高值，兩組間數(shù)據(jù)出現(xiàn)明顯差異，#P<0.01(圖 3-1-1)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)稱量小鼠體重(BW)、取出小鼠心臟后重量(HW)計(jì)算 HW/BW,結(jié)果顯示 HW/BW：WT 組(5.08±0.189mg/g)vs.WT+AngII 組(6.07±0.46mg/g)，，p35-KO 組(5.16 ±1.44mg/g)vs.p35-KO+AngII 組(7.10±0.328mg/g)，WT+AngII組vs.p35-KO+AngII組有極其顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異*P<0.001(圖 3-1-2)。其中不同組間小鼠心臟實(shí)物圖從左至右分別是 p35-KO+AngII 組、WT+AngII 組、WT 組見(圖 3-1-3),有實(shí)物圖可見 AngII 微量滲透泵灌注后 4 周是心臟增大，其中 p35-KO+AngII 組增大較 WT+AngII 組明顯。圖 3-1-1 圖 3-1-2

Fig.3-5 Autophagy圖 3-5-1：p62 表達(dá) WT+AngII 組 vs.WT 組*P<0.05；p35-KO 組 vs.WT 組#P<0.01；p35-KO+AngII 組 vs.WT 組**P<0.001；LC3 II/I 的比值：WT+AngII、p35-KO+AngII、p35-KO組 vs.WT 組*P<0.01。圖 3-5-2：p62 的免疫組織化學(xué)染色，可以明顯的看出 p35-KO+AngII 組p62 高表達(dá)，n=3。3.6 IL-12p35 基因的缺失增加了 JAK2/STAT4 的磷酸化我們通過免疫印記實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠心臟內(nèi) JAK2/STAT4 通路的磷酸化，結(jié)果顯示IL-12p35 基因的缺失顯著增加了 JAK2/STAT4 的磷酸化，p35-KO+AngII、p35-KO組與 WT 組相比 JAK2 通道的磷酸化增加，*P<0.01；p35-KO+AngII、p35-KO 組與 WT 組相比 STAT4 的磷酸化顯著增加，*P<0.01,P35-KO+AngII 與 WT+AngII 組相比 STAT4 的磷酸化增加并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，#P<0.05(圖 6)。
【學(xué)位授予單位】：河北工程大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R542.2;R544.1

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本文編號(hào)：2639922