【摘要】：脂滴相關(guān)蛋白PLIN2通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積及抑制膽固醇流出而促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成,同時(shí)還與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性密切相關(guān),因此在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。有研究表明小分子GTP結(jié)合蛋白R(shí)ab18與PLIN2共定位于脂滴上,過(guò)表達(dá)Rab18能使脂滴上PLIN2的數(shù)目減少。同時(shí),Rab18過(guò)表達(dá)還可引起脂滴-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的接觸。用RNA干擾或brefeldin A處理降低PLIN2表達(dá)后,可引起同樣的形態(tài)學(xué)改變。這提示Rab18與PLIN2之間存在著某種聯(lián)系,Rab18可能是PLIN2的一個(gè)上游調(diào)節(jié)基因。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)可與Ox-LDL協(xié)同上調(diào)PLIN2表達(dá)并使細(xì)胞內(nèi)脂滴的蓄積極大地增強(qiáng)。此外,有研究發(fā)現(xiàn)一些PKC亞型的功能與Rab蛋白密切相關(guān)。依據(jù)這些研究,我們提出“Rab18通過(guò)調(diào)控PKCα表達(dá),影響PLIN2介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積”的理論假設(shè)。在本研究中,我們分別使用動(dòng)物學(xué)及細(xì)胞學(xué)研究方法,觀察動(dòng)脈粥樣硬化的ApoE-/-(載脂蛋白E敲除)小鼠主動(dòng)脈組織中Rab18、PKCα和PLIN2蛋白表達(dá)情況,過(guò)表達(dá)活化型或失活型Rab18對(duì)荷脂THP-1巨噬細(xì)胞中PKCα、PLIN2表達(dá)及脂質(zhì)蓄積的影響,以及激活或抑制PKCα對(duì)過(guò)表達(dá)Rab18的荷脂THP-1巨噬細(xì)胞中PKCα、PLIN2表達(dá)及脂質(zhì)蓄積的影響,探討Rab18對(duì)PLIN2介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積的影響及作用機(jī)制。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,使用8周齡的ApoE-/-小鼠24只,隨機(jī)分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組(對(duì)照組8只,實(shí)驗(yàn)組16只),飼喂12周,其中對(duì)照組予以普通飼料,實(shí)驗(yàn)組予以高膽固醇飼料,處死小鼠前從實(shí)驗(yàn)組中隨機(jī)分出8只予以禁食48h處理。體視顯微鏡下觀察小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化病變情況,主動(dòng)脈切片HE染色、油紅O染色、Masson染色觀察小鼠主動(dòng)脈竇病變情況,Western blot檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈組織Rab18、PKCα和PLIN2蛋白表達(dá)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,(1)Ox-LDL(50 mg/L)處理THP-1巨噬細(xì)胞不同時(shí)間段(0,6,12,24 h);(2)將野生型Rab18(WT)、顯性突變型Rab18(Q67L)和顯性負(fù)性突變型Rab18(S22N)的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)脂質(zhì)法轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞,Ox-LDL(50 mg/L)處理24 h;(3)將顯性突變型Rab18(Q67L)慢病毒表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞,Ox-LDL(50 mg/L)處理24 h,然后分別用PKC激動(dòng)劑PMA(100 nmol/L)和抑制劑Calphostin C(300 nmol/L)處理16 h。采用Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Rab18、PKCα和PLIN2蛋白表達(dá)情況,油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積蓄情況。研究發(fā)現(xiàn),(1)動(dòng)脈粥樣硬化的小鼠主動(dòng)脈組織內(nèi)Rab18、PKCα和PLIN2蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高,其中禁食48 h小鼠Rab18水平進(jìn)一步上調(diào),PKCα和PLIN2表達(dá)水平較實(shí)驗(yàn)組中未禁食小鼠下降。(2)隨著Ox-LDL處理時(shí)間的增加,THP-1巨噬細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)Rab18、PKCα和PLIN2的蛋白表達(dá)增加,其中PKCα和PLIN2表達(dá)增加較Rab18出現(xiàn)早,同時(shí)在此過(guò)程中胞漿內(nèi)荷脂情況越來(lái)越明顯。(3)Rab18(WT)及Rab18(Q67L)轉(zhuǎn)染組THP-1細(xì)胞內(nèi)PKCα和PLIN2表達(dá)明顯降低,細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積減少,而Rab18(S22N)轉(zhuǎn)染組PKCα和PLIN2表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積較對(duì)照組無(wú)明顯差異。(4)100 nmol/L PMA抵消過(guò)表達(dá)Rab18(Q67L)對(duì)PKCα、PLIN2的抑制作用,細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積有所增加;300 nmol/L Calphostin C則協(xié)同增強(qiáng)過(guò)表達(dá)Rab18(Q67L)對(duì)荷脂THP-1巨噬細(xì)胞內(nèi)PKCα、PLIN2表達(dá)的抑制作用,同時(shí)進(jìn)一步減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積蓄。研究結(jié)果,Rab18通過(guò)PKCα下調(diào)PLIN2表達(dá),從而減少巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積。
【圖文】：

2 章 動(dòng)脈粥樣硬化的 ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈組織內(nèi) Rab18、PKCα 和 PLIN2 蛋白表達(dá)升性密切相關(guān)，因此我們采用 Masson 染色觀察 Apo-/-小鼠主動(dòng)脈竇纖維，結(jié)果顯示，HF 組和 HF-fasting 組斑塊內(nèi)膠原纖維含量較 C。

圖 1.2 小鼠主動(dòng)脈竇斑塊形成情況（×40）注： *P < 0.05，vs. control（n=6）動(dòng)脈粥樣硬化小鼠主動(dòng)脈組織內(nèi) Rab18、PKCα 和 PLIN顯上調(diào)estern blot 檢測(cè)各組小鼠主動(dòng)脈組織內(nèi) Rab18、PKCα 和 PLIN2 蛋結(jié)果顯示（圖 1.3），與 Control 組相比，HF 組和 HF-fasting 組小鼠 Rab18、PKCα 和 PLIN2 蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)，其中 HF-fasting 平較 HF 組進(jìn)一步上調(diào)，，而 PKCα、PLIN2 蛋白表達(dá)則較 HF 組下
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R54

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2637643