【摘要】：背景:心肌纖維化(Myocardial Fibrosis)是由于心肌成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖、細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉淀、心肌硬度增加等而引起的心臟功能失調(diào)的一種病理性現(xiàn)象,一般是在高血壓、心肌缺血以及瓣膜性心臟病等心血管疾病的基礎(chǔ)上形成。心肌纖維化的發(fā)生是左心室舒張功能異常的主要影響因素,也是心源性猝死的危險(xiǎn)因素之一。病理學(xué)研究表明,心肌纖維化表現(xiàn)為心肌膠原蛋白的過(guò)度積累,血管周圍的纖維組織向心肌周圍彌散性分布,并最終引起心力衰竭。研究發(fā)現(xiàn),心肌纖維化的發(fā)生與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)的異常相關(guān),且涉及炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度異常以及細(xì)胞因子的異常。然而,由于其復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制,目前臨床上對(duì)于心肌纖維化尚無(wú)統(tǒng)一有效的治療方式。凝血酶(Thrombin)是一種由凝血酶原裂解而來(lái)的絲氨酸蛋白酶。凝血酶除了參與機(jī)體正常的凝血過(guò)程,還是血小板的重要激活物,其參與血小板活性和炎癥反應(yīng)。正常組織中,凝血酶具有促炎和促纖維化作用,而在一些病理狀態(tài)下,例如組織纖維化、血管新生以及血栓等情況下,凝血酶表現(xiàn)較高的活性。因此,有效調(diào)控凝血酶的活性對(duì)于心肌功能異常類疾病的治療具有潛在意義。凝血酶在細(xì)胞外發(fā)揮調(diào)控作用的主要作用機(jī)制是通過(guò)激活細(xì)胞表面的蛋白酶激活受體(Protease-activatedreceptors,PARs),進(jìn)而活化效應(yīng)細(xì)胞的胞內(nèi)信號(hào)通路,調(diào)控細(xì)胞的增殖、代謝等過(guò)程。PAR存在于許多組織和細(xì)胞中,可介導(dǎo)腫瘤的生長(zhǎng)和細(xì)胞的凋亡。研究報(bào)道,PAR-1作為PAR受體家族成員之一,可介導(dǎo)多種炎癥反應(yīng)、腫瘤侵襲和血管生成等。且在心肌纖維化過(guò)程中,PAR-1的表達(dá)顯著升高,進(jìn)而促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞的活化和膠原蛋白合成的增加。此外,PAR-1作為凝血酶的主要受體之一,可通過(guò)結(jié)合多條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并促進(jìn)其活化,進(jìn)而參與調(diào)控多種細(xì)胞類型的反應(yīng)。G蛋白(Gprotein)是多種信號(hào)途徑的重要蛋白,在細(xì)胞跨膜信號(hào)傳導(dǎo)中起著重要作用。Gq蛋白是G蛋白的一種,Gq蛋白是PAR-1受體下游重要的效應(yīng)蛋白之一,在多種信號(hào)通路的活化中發(fā)揮調(diào)控作用。此外,Gq蛋白還可耦聯(lián)多種受體,促進(jìn)Gq蛋白的活化,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣離子向胞漿釋放,從而激活蛋白酶C(Protein kinase C,PKC)產(chǎn)生生物效應(yīng)。PKC介導(dǎo)的信號(hào)通路在纖維化發(fā)展進(jìn)程中調(diào)控成纖維細(xì)胞的胞內(nèi)事件。在凝血酶引起的心肌纖維化中,不同的PKC亞型在細(xì)胞增殖及DNA合成中均發(fā)揮重要作用。新型抗凝藥是一種重要的靶向藥物,它通過(guò)直接降低凝血酶活性進(jìn)而抑制血栓的形成。該藥物具有目的性強(qiáng)、對(duì)身體副作用較小等特點(diǎn),在臨床治療中具有較大的前景。新型抗凝藥的作用機(jī)制是通過(guò)抑制凝血級(jí)聯(lián)中的兩個(gè)重要靶點(diǎn)Xa和Ila。其中,凝血因子X(jué)a作為外源性凝血途徑和內(nèi)源性凝血途徑的重要交匯點(diǎn),其發(fā)揮作用時(shí),凝血因子首先通過(guò)在磷脂膜表面形凝血酶復(fù)合物,進(jìn)而激活凝血酶原向凝血酶轉(zhuǎn)變的信號(hào),促進(jìn)凝血酶的合成。阿哌沙班(Apixaban)是基于Xa研發(fā)出的一種重要新型抗凝藥,是直接X(jué)a因子抑制劑,它可通過(guò)與Xa因子的活性位點(diǎn)結(jié)合,阻止凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟?減少凝血酶的合成,從而發(fā)揮抗凝作用。然而阿哌沙班作為臨床上常用的新型口服抗凝藥之一,是否可以通過(guò)改變凝血酶的活性介導(dǎo)心肌纖維化的發(fā)展尚無(wú)報(bào)道�；谝陨媳尘�,本研究首先建立缺血誘導(dǎo)的心肌纖維化小鼠模型,并給于不同濃度的阿哌沙班處理,同時(shí)設(shè)置貝那普利(Benazepril)陽(yáng)性對(duì)照組和假手術(shù)(Sham surgery)組;檢測(cè)阿哌沙班對(duì)小鼠心臟血壓、心肌指數(shù)、膠原蛋白儲(chǔ)備、凝血酶活性以及PAR-1表達(dá)的影響,以此評(píng)估阿哌沙班對(duì)小鼠心肌纖維化的影響。體外實(shí)驗(yàn)利用凝血酶處理心肌成纖維細(xì)胞,研究阿哌沙班對(duì)心肌成纖維細(xì)胞膠原蛋白存儲(chǔ)的影響并探討其作用機(jī)制。最后,本研究利用關(guān)鍵分子Gq和PKC的抑制劑預(yù)處理凝血酶誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞,在細(xì)胞水平驗(yàn)證阿哌沙班改善心肌纖維化的機(jī)制;此外,本研究再次構(gòu)建心肌纖維化小鼠模型,體內(nèi)驗(yàn)證阿哌沙班改善心肌纖維化的作用機(jī)制。本文旨在探討阿哌沙班對(duì)心肌纖維化的保護(hù)機(jī)制,為阿哌沙班的臨床應(yīng)用提供充足的理論基礎(chǔ)。目的:本研究首先考察阿哌沙班對(duì)心肌纖維化小鼠心肌功能的保護(hù)效應(yīng)以及對(duì)膠原蛋白沉積和凝血酶活性的影響。其次從細(xì)胞及分子水平探討阿哌沙班保護(hù)心肌纖維化的分子機(jī)制。最后通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證Gq/PKC信號(hào)通路在阿哌沙班保護(hù)缺血誘導(dǎo)性心肌纖維化過(guò)程中的作用機(jī)制。方法:(1)①構(gòu)建缺血誘導(dǎo)的心肌纖維化小鼠模型,不同濃度的阿哌沙班給藥處理,同時(shí)設(shè)置貝那普利陽(yáng)性對(duì)照組和假手術(shù)組;②HE(Hematoxylin-eosinstaining)染色檢測(cè)不同處理組小鼠心肌纖維化情況;③全自動(dòng)生理記錄儀記錄不同處理組小鼠左心室收縮壓(Left ventricular systolic pressure,LVSP)和左心室末期舒張壓(Left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP);④稱取小鼠體重和心臟重量,計(jì)算不同處理組小鼠左心室重量指數(shù)(Left Ventricular Weight Index,LVWI)和右心室重量指數(shù)(Right Ventricular Weight Index,RVWI);⑤實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(Quantitative Real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR)檢測(cè)心肌組織中 I 型膠原蛋白(Collagen alpha-1(I)chain,Colla1)、Ⅲ 型膠原蛋白(Collagen alpha-1(Ⅲ)chain,Colla3)和PAR-1等基因mRNA的表達(dá);⑥Western blot檢測(cè)心肌組織中Colla1、Colla3和PAR-1等蛋白的表達(dá);⑦酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)小鼠外周血中凝血酶的活性變化;(2)①分離培養(yǎng)小鼠原代心肌成纖維細(xì)胞,用不同濃度凝血酶處理;②構(gòu)建Gq siRNA(si-Gq)轉(zhuǎn)染心肌成纖維細(xì)胞模型;③免疫熒光觀察心肌成纖維細(xì)胞中Colla1和Colla3的含量;④Real-time PCR和 Western blot 檢測(cè) Colla1、Colla3 的 mRNA 和蛋白表達(dá);⑤Western blot 檢測(cè) PKC信號(hào)通路的活化;(3)①細(xì)胞分組:Control、thrombin、thrombin+GPA2A、thrombin+GF109203X;② Western blot檢測(cè) Colla1、Coll a3、p-PKCα 和 PKCα 的蛋白表達(dá);③小鼠分為假手術(shù)組(sham)、心肌缺血(myocardial ischemia,MI)組,阿哌沙班給藥組(MI+Api)、PKC抑制劑GF109203X作用組(MI+Api+GF)和Gq蛋白拮抗劑GPA2A作用組(MI+Api+GPA);④HE染色檢測(cè)不同處理組小鼠心肌纖維化情況;⑤全自動(dòng)生理記錄儀記錄不同處理組小鼠LVSP和左心室末期舒張壓LVEDP;⑥稱取小鼠體重和心臟重量,計(jì)算不同處理組小鼠LVWI和RVWI;⑦Real-time PCR和Western blot檢測(cè)心、肌組織中Colla1、Colla3的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:(1)與假手術(shù)組相比較,心肌纖維化小鼠的心肌纖維化程度顯著升高,而阿哌沙班給藥顯著改善小鼠的心肌纖維化,且高濃度的阿哌沙班效果更顯著,高濃度阿哌沙班與貝那普利的治療效果沒(méi)有顯著差異;心肌纖維化小鼠LVSP顯著降低,LVEDP顯著升高,阿哌沙班治療改善了 LVSP和LVEDP的水平,且高濃度的阿哌沙班效果更顯著,高濃度阿哌沙班與貝那普利的治療效果沒(méi)有顯著差異;心肌纖維化小鼠的LVWI和RVWI顯著升高,阿哌沙班給藥后顯著降低了其心肌指數(shù),且高濃度的阿哌沙班效果更顯著,高濃度阿哌沙班與貝那普利的治療效果沒(méi)有顯著差異;心肌纖維化小鼠Col1a1和Col1a3的表達(dá)顯著升高,阿哌沙班給藥顯著降低Col1a1和Col1a3的表達(dá),且高濃度的阿哌沙班效果更顯著,高濃度阿哌沙班與貝那普利的治療效果沒(méi)有顯著差異;心肌纖維化小鼠凝血酶活性顯著升高,阿哌沙班給藥顯著降低了凝血酶活性,且高濃度的阿哌沙班效果更好,高濃度阿哌沙班與貝那普利的治療效果沒(méi)有顯著差異;阿哌沙班治療對(duì)心肌纖維化小鼠心肌組織中的PAR-1含量沒(méi)有影響。(2)心肌成纖維細(xì)胞經(jīng)凝血酶處理后Col1a1、Col1a3的表達(dá)顯著增加;心肌成纖維細(xì)胞經(jīng)凝血酶處理后PKC信號(hào)通路被活化;抑制Gq蛋白阻止凝血酶誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞膠原儲(chǔ)備;抑制Gq蛋白阻止凝血酶誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞PKC信號(hào)通路的活化。(3)GPA2A或GF109203X預(yù)處理顯著逆轉(zhuǎn)凝血酶引起的Col1a1、Col1a3表達(dá)升高;阿哌沙班處理顯著降低小鼠心肌纖維化水平,GPA2A或GF109203X處理顯著抑制阿哌沙班對(duì)小鼠心肌纖維化的保護(hù)作用;阿哌沙班處理顯著降低小鼠LVSP及LVEDP的水平,GPA2A或GF109203X處理顯著抑制阿哌沙班對(duì)心肌LVSP和LVEDP指標(biāo)的影響;阿哌沙班處理顯著降低LVWI和RVWI的水平,GPA2A或GF109203X處理顯著抑制阿哌沙班對(duì)LVWI和RVWI的影響。結(jié)論:(1)阿哌沙班顯著緩解缺血引起的小鼠心肌纖維化。(2)凝血酶通過(guò)活化Gq/PKC信號(hào)通路促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞中膠原儲(chǔ)備。(3)Gq/PKC信號(hào)通路的活化參與阿哌沙班保護(hù)小鼠心肌纖維化過(guò)程。
【圖文】：

班組和貝那普利陽(yáng)性對(duì)照組。ＨＥ染色結(jié)果表明，與Ｓｈａｍ組相比，ＭＩ組的纖維化程逡逑度顯著增強(qiáng)，阿哌沙班治療顯著改善ＭＩ組引起的心肌纖維化，且高濃度阿哌沙班的逡逑效果更顯著（圖１．１）。提示阿哌沙班具有改善心肌纖維化的作用，且高濃度的阿哌沙逡逑班效果更顯著。逡逑＿＿邋＿逡逑Ｓｈａｍ邐Ｍｌ邐Ｍｌ＋Ａｐｉ－Ｌ邋Ｍｌ＋Ａｐｉ－Ｈ邐Ｍｌ＋Ｂｅｎ逡逑圖１．１阿哌沙班對(duì)小鼠心肌纖維化程度的影響逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｅｆｆｅｃｔｓ邋ｏｆ邋Ａｐｉ邋ｏｎ邋ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ邋ｆｉｂｒｏｓｉｓ邋ｏｆ邋ｍｉｃｅ逡逑２．２阿哌沙班對(duì)小鼠心臟收縮壓和舒張壓的影響逡逑為研宄阿哌沙班對(duì)心肌纖維化小鼠血壓的影響，基于上述小鼠分組，利用血壓記逡逑錄儀記錄不同處理組小鼠的血壓變化情況。結(jié)果顯示，，與Ｓｈａｍ組相比，缺血誘導(dǎo)的逡逑心肌纖維化小鼠（ＭＩ組）左心室收縮壓（ｌｅｆｔ邋ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ邋ｓｙｓｔｏｌｉｃ邋ｐｒｅｓｓｕｒｅ，ＬＶＳＰ）顯逡逑著降低，心室末期舒張壓（ｌｅｆｔ邋ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ邋ｅｎｄ－ｄｉａｓｔｏｌｉｃ邋ｐｒｅｓｓｕｒｅ，邋ＬＶＥＤＰ）顯著升高；逡逑利用阿哌沙班治療后ＬＶＳＰ明顯升高，而ＬＶＥＤＰ顯著降低，且高濃度的阿

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