【摘要】：背景:心肌纖維化(Myocardial Fibrosis)是由于心肌成纖維細胞過度增殖、細胞外基質(zhì)過度沉淀、心肌硬度增加等而引起的心臟功能失調(diào)的一種病理性現(xiàn)象,一般是在高血壓、心肌缺血以及瓣膜性心臟病等心血管疾病的基礎上形成。心肌纖維化的發(fā)生是左心室舒張功能異常的主要影響因素,也是心源性猝死的危險因素之一。病理學研究表明,心肌纖維化表現(xiàn)為心肌膠原蛋白的過度積累,血管周圍的纖維組織向心肌周圍彌散性分布,并最終引起心力衰竭。研究發(fā)現(xiàn),心肌纖維化的發(fā)生與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)的異常相關(guān),且涉及炎性反應、氧化應激反應、內(nèi)皮細胞功能失調(diào)、細胞內(nèi)鈣離子濃度異常以及細胞因子的異常。然而,由于其復雜的發(fā)病機制,目前臨床上對于心肌纖維化尚無統(tǒng)一有效的治療方式。凝血酶(Thrombin)是一種由凝血酶原裂解而來的絲氨酸蛋白酶。凝血酶除了參與機體正常的凝血過程,還是血小板的重要激活物,其參與血小板活性和炎癥反應。正常組織中,凝血酶具有促炎和促纖維化作用,而在一些病理狀態(tài)下,例如組織纖維化、血管新生以及血栓等情況下,凝血酶表現(xiàn)較高的活性。因此,有效調(diào)控凝血酶的活性對于心肌功能異常類疾病的治療具有潛在意義。凝血酶在細胞外發(fā)揮調(diào)控作用的主要作用機制是通過激活細胞表面的蛋白酶激活受體(Protease-activatedreceptors,PARs),進而活化效應細胞的胞內(nèi)信號通路,調(diào)控細胞的增殖、代謝等過程。PAR存在于許多組織和細胞中,可介導腫瘤的生長和細胞的凋亡。研究報道,PAR-1作為PAR受體家族成員之一,可介導多種炎癥反應、腫瘤侵襲和血管生成等。且在心肌纖維化過程中,PAR-1的表達顯著升高,進而促進心肌成纖維細胞的活化和膠原蛋白合成的增加。此外,PAR-1作為凝血酶的主要受體之一,可通過結(jié)合多條細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路并促進其活化,進而參與調(diào)控多種細胞類型的反應。G蛋白(Gprotein)是多種信號途徑的重要蛋白,在細胞跨膜信號傳導中起著重要作用。Gq蛋白是G蛋白的一種,Gq蛋白是PAR-1受體下游重要的效應蛋白之一,在多種信號通路的活化中發(fā)揮調(diào)控作用。此外,Gq蛋白還可耦聯(lián)多種受體,促進Gq蛋白的活化,進而促進細胞內(nèi)鈣離子向胞漿釋放,從而激活蛋白酶C(Protein kinase C,PKC)產(chǎn)生生物效應。PKC介導的信號通路在纖維化發(fā)展進程中調(diào)控成纖維細胞的胞內(nèi)事件。在凝血酶引起的心肌纖維化中,不同的PKC亞型在細胞增殖及DNA合成中均發(fā)揮重要作用。新型抗凝藥是一種重要的靶向藥物,它通過直接降低凝血酶活性進而抑制血栓的形成。該藥物具有目的性強、對身體副作用較小等特點,在臨床治療中具有較大的前景。新型抗凝藥的作用機制是通過抑制凝血級聯(lián)中的兩個重要靶點Xa和Ila。其中,凝血因子Xa作為外源性凝血途徑和內(nèi)源性凝血途徑的重要交匯點,其發(fā)揮作用時,凝血因子首先通過在磷脂膜表面形凝血酶復合物,進而激活凝血酶原向凝血酶轉(zhuǎn)變的信號,促進凝血酶的合成。阿哌沙班(Apixaban)是基于Xa研發(fā)出的一種重要新型抗凝藥,是直接Xa因子抑制劑,它可通過與Xa因子的活性位點結(jié)合,阻止凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟?減少凝血酶的合成,從而發(fā)揮抗凝作用。然而阿哌沙班作為臨床上常用的新型口服抗凝藥之一,是否可以通過改變凝血酶的活性介導心肌纖維化的發(fā)展尚無報道。基于以上背景,本研究首先建立缺血誘導的心肌纖維化小鼠模型,并給于不同濃度的阿哌沙班處理,同時設置貝那普利(Benazepril)陽性對照組和假手術(shù)(Sham surgery)組;檢測阿哌沙班對小鼠心臟血壓、心肌指數(shù)、膠原蛋白儲備、凝血酶活性以及PAR-1表達的影響,以此評估阿哌沙班對小鼠心肌纖維化的影響。體外實驗利用凝血酶處理心肌成纖維細胞,研究阿哌沙班對心肌成纖維細胞膠原蛋白存儲的影響并探討其作用機制。最后,本研究利用關(guān)鍵分子Gq和PKC的抑制劑預處理凝血酶誘導的心肌成纖維細胞,在細胞水平驗證阿哌沙班改善心肌纖維化的機制;此外,本研究再次構(gòu)建心肌纖維化小鼠模型,體內(nèi)驗證阿哌沙班改善心肌纖維化的作用機制。本文旨在探討阿哌沙班對心肌纖維化的保護機制,為阿哌沙班的臨床應用提供充足的理論基礎。目的:本研究首先考察阿哌沙班對心肌纖維化小鼠心肌功能的保護效應以及對膠原蛋白沉積和凝血酶活性的影響。其次從細胞及分子水平探討阿哌沙班保護心肌纖維化的分子機制。最后通過體內(nèi)實驗進一步驗證Gq/PKC信號通路在阿哌沙班保護缺血誘導性心肌纖維化過程中的作用機制。方法:(1)①構(gòu)建缺血誘導的心肌纖維化小鼠模型,不同濃度的阿哌沙班給藥處理,同時設置貝那普利陽性對照組和假手術(shù)組;②HE(Hematoxylin-eosinstaining)染色檢測不同處理組小鼠心肌纖維化情況;③全自動生理記錄儀記錄不同處理組小鼠左心室收縮壓(Left ventricular systolic pressure,LVSP)和左心室末期舒張壓(Left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP);④稱取小鼠體重和心臟重量,計算不同處理組小鼠左心室重量指數(shù)(Left Ventricular Weight Index,LVWI)和右心室重量指數(shù)(Right Ventricular Weight Index,RVWI);⑤實時熒光定量 PCR(Quantitative Real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR)檢測心肌組織中 I 型膠原蛋白(Collagen alpha-1(I)chain,Colla1)、Ⅲ 型膠原蛋白(Collagen alpha-1(Ⅲ)chain,Colla3)和PAR-1等基因mRNA的表達;⑥Western blot檢測心肌組織中Colla1、Colla3和PAR-1等蛋白的表達;⑦酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測小鼠外周血中凝血酶的活性變化;(2)①分離培養(yǎng)小鼠原代心肌成纖維細胞,用不同濃度凝血酶處理;②構(gòu)建Gq siRNA(si-Gq)轉(zhuǎn)染心肌成纖維細胞模型;③免疫熒光觀察心肌成纖維細胞中Colla1和Colla3的含量;④Real-time PCR和 Western blot 檢測 Colla1、Colla3 的 mRNA 和蛋白表達;⑤Western blot 檢測 PKC信號通路的活化;(3)①細胞分組:Control、thrombin、thrombin+GPA2A、thrombin+GF109203X;② Western blot檢測 Colla1、Coll a3、p-PKCα 和 PKCα 的蛋白表達;③小鼠分為假手術(shù)組(sham)、心肌缺血(myocardial ischemia,MI)組,阿哌沙班給藥組(MI+Api)、PKC抑制劑GF109203X作用組(MI+Api+GF)和Gq蛋白拮抗劑GPA2A作用組(MI+Api+GPA);④HE染色檢測不同處理組小鼠心肌纖維化情況;⑤全自動生理記錄儀記錄不同處理組小鼠LVSP和左心室末期舒張壓LVEDP;⑥稱取小鼠體重和心臟重量,計算不同處理組小鼠LVWI和RVWI;⑦Real-time PCR和Western blot檢測心、肌組織中Colla1、Colla3的mRNA和蛋白表達水平。結(jié)果:(1)與假手術(shù)組相比較,心肌纖維化小鼠的心肌纖維化程度顯著升高,而阿哌沙班給藥顯著改善小鼠的心肌纖維化,且高濃度的阿哌沙班效果更顯著,高濃度阿哌沙班與貝那普利的治療效果沒有顯著差異;心肌纖維化小鼠LVSP顯著降低,LVEDP顯著升高,阿哌沙班治療改善了 LVSP和LVEDP的水平,且高濃度的阿哌沙班效果更顯著,高濃度阿哌沙班與貝那普利的治療效果沒有顯著差異;心肌纖維化小鼠的LVWI和RVWI顯著升高,阿哌沙班給藥后顯著降低了其心肌指數(shù),且高濃度的阿哌沙班效果更顯著,高濃度阿哌沙班與貝那普利的治療效果沒有顯著差異;心肌纖維化小鼠Col1a1和Col1a3的表達顯著升高,阿哌沙班給藥顯著降低Col1a1和Col1a3的表達,且高濃度的阿哌沙班效果更顯著,高濃度阿哌沙班與貝那普利的治療效果沒有顯著差異;心肌纖維化小鼠凝血酶活性顯著升高,阿哌沙班給藥顯著降低了凝血酶活性,且高濃度的阿哌沙班效果更好,高濃度阿哌沙班與貝那普利的治療效果沒有顯著差異;阿哌沙班治療對心肌纖維化小鼠心肌組織中的PAR-1含量沒有影響。(2)心肌成纖維細胞經(jīng)凝血酶處理后Col1a1、Col1a3的表達顯著增加;心肌成纖維細胞經(jīng)凝血酶處理后PKC信號通路被活化;抑制Gq蛋白阻止凝血酶誘導的心肌成纖維細胞膠原儲備;抑制Gq蛋白阻止凝血酶誘導的心肌成纖維細胞PKC信號通路的活化。(3)GPA2A或GF109203X預處理顯著逆轉(zhuǎn)凝血酶引起的Col1a1、Col1a3表達升高;阿哌沙班處理顯著降低小鼠心肌纖維化水平,GPA2A或GF109203X處理顯著抑制阿哌沙班對小鼠心肌纖維化的保護作用;阿哌沙班處理顯著降低小鼠LVSP及LVEDP的水平,GPA2A或GF109203X處理顯著抑制阿哌沙班對心肌LVSP和LVEDP指標的影響;阿哌沙班處理顯著降低LVWI和RVWI的水平,GPA2A或GF109203X處理顯著抑制阿哌沙班對LVWI和RVWI的影響。結(jié)論:(1)阿哌沙班顯著緩解缺血引起的小鼠心肌纖維化。(2)凝血酶通過活化Gq/PKC信號通路促進心肌成纖維細胞中膠原儲備。(3)Gq/PKC信號通路的活化參與阿哌沙班保護小鼠心肌纖維化過程。
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班組和貝那普利陽性對照組。ＨＥ染色結(jié)果表明，與Ｓｈａｍ組相比，ＭＩ組的纖維化程逡逑度顯著增強，阿哌沙班治療顯著改善ＭＩ組引起的心肌纖維化，且高濃度阿哌沙班的逡逑效果更顯著（圖１．１）。提示阿哌沙班具有改善心肌纖維化的作用，且高濃度的阿哌沙逡逑班效果更顯著。逡逑＿＿邋＿逡逑Ｓｈａｍ邐Ｍｌ邐Ｍｌ＋Ａｐｉ－Ｌ邋Ｍｌ＋Ａｐｉ－Ｈ邐Ｍｌ＋Ｂｅｎ逡逑圖１．１阿哌沙班對小鼠心肌纖維化程度的影響逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｅｆｆｅｃｔｓ邋ｏｆ邋Ａｐｉ邋ｏｎ邋ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ邋ｆｉｂｒｏｓｉｓ邋ｏｆ邋ｍｉｃｅ逡逑２．２阿哌沙班對小鼠心臟收縮壓和舒張壓的影響逡逑為研宄阿哌沙班對心肌纖維化小鼠血壓的影響，基于上述小鼠分組，利用血壓記逡逑錄儀記錄不同處理組小鼠的血壓變化情況。結(jié)果顯示，，與Ｓｈａｍ組相比，缺血誘導的逡逑心肌纖維化小鼠（ＭＩ組）左心室收縮壓（ｌｅｆｔ邋ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ邋ｓｙｓｔｏｌｉｃ邋ｐｒｅｓｓｕｒｅ，ＬＶＳＰ）顯逡逑著降低，心室末期舒張壓（ｌｅｆｔ邋ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ邋ｅｎｄ－ｄｉａｓｔｏｌｉｃ邋ｐｒｅｓｓｕｒｅ，邋ＬＶＥＤＰ）顯著升高；逡逑利用阿哌沙班治療后ＬＶＳＰ明顯升高，而ＬＶＥＤＰ顯著降低，且高濃度的阿

本文編號：2632712