【摘要】：[背景與目的]動脈粥樣硬化(As)是由脂質(zhì)代謝紊亂等多種因素引起的一種血管退行性病變,嚴(yán)重危害人類健康。在As眾多的發(fā)病機(jī)理中,巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的形成構(gòu)成其核心環(huán)節(jié)。因此,減少巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成對As的防治具有重要意義。以往研究表明,脂蛋白脂酶(LPL)是水解血漿甘油三酯的關(guān)鍵限速酶,對降低血漿甘油三酯水平至關(guān)重要。然而,LPL在巨噬細(xì)胞中卻通過介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成,從而發(fā)揮促As的作用。探索調(diào)控LPL表達(dá)的作用機(jī)制,減少巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積,對于防治As具有重要意義。藻藍(lán)蛋白(PC)是一種存在于藻類中的色素蛋白,在螺旋藻中的含量約為10%~20%,常溫下結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。研究表明,PC在抗氧化、抗腫瘤、免疫應(yīng)答等方面發(fā)揮著多種生物學(xué)功能,但其是否通過減少巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積從而影響泡沫細(xì)胞形成的機(jī)制尚未闡明。絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶7(TAK1),能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與凋亡,介導(dǎo)多種促炎癥和促存活信號通路的激活,參與As的病理進(jìn)程。應(yīng)激活化蛋白激酶(JNK)是位于TAK1下游的因子,TAK1表達(dá)升高可增加磷酸化JNK水平,從而引起JNK下游因子的激活或抑制。轉(zhuǎn)錄激活因子3(ATF3),是ATF/環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族的成員,位于JNK下游,它是富含甘油三酯的脂蛋白脂解產(chǎn)物的關(guān)鍵反應(yīng)基因,能夠誘導(dǎo)促炎因子聚集,促進(jìn)As的發(fā)生。然而,TAK1/JNK/ATF3信號途徑是否參與PC調(diào)控巨噬細(xì)胞LPL表達(dá)及脂質(zhì)蓄積的機(jī)制尚不清楚。miR-10a-5p是新近發(fā)現(xiàn)的一個RNA分子,與腫瘤的發(fā)生、炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),miR-10a-5p能夠靶向結(jié)合TAK1,從而增加As斑塊的面積,加速As的發(fā)生。但miR-10a-5p是否參與PC調(diào)控巨噬細(xì)胞LPL表達(dá)及脂質(zhì)蓄積的機(jī)制尚不明確。因此,本研究的目的是從脂質(zhì)代謝的角度,探究PC對巨噬細(xì)胞LPL表達(dá)及脂質(zhì)蓄積的影響機(jī)制。[方法]THP-1細(xì)胞置于10%胎牛血清(PBS)的RPMI 1640培養(yǎng)基(含10U/mL青霉素和10U/mL鏈霉素)中培養(yǎng),將細(xì)胞培養(yǎng)箱溫度保持在37℃,同時保證箱內(nèi)5%的CO_2濃度。用160nmol/L的佛波醇(PMA)孵育THP-1細(xì)胞48小時,促進(jìn)其分化,轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞,50μg/ml的氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)無血清培養(yǎng)基處理細(xì)胞。首先,PC(5、10、20μg/ml)或PBS孵育巨噬細(xì)胞6、12、24小時,然后用RT-PCR和Western Blot檢測LPL mRNA及表達(dá),LPL活性比色法定量檢測試劑盒檢測LPL活性,高效液相色譜(HPLC)用于檢測細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量變化情況;染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)和熒光素酶報告基因(Luciferase)分別檢測PC對轉(zhuǎn)錄因子ATF3與LPL啟動子區(qū)結(jié)合以及LPL啟動子活性的影響,RT-PCR和Western Blot分別檢測PC對ATF3 mRNA及表達(dá),LPL mRNA及表達(dá)的影響;接著,使用TAK1過表達(dá)質(zhì)粒,JNK激活劑茴香霉素和ATF3過表達(dá)質(zhì)粒處理后,RT-PCR和Western Blot分別檢測PC對TAK1 mRNA及表達(dá)、JNK及其磷酸化水平、ATF3 mRNA及表達(dá),LPL mRNA及表達(dá)的影響,驗證PC是否通過TAK1/JNK/ATF3信號通路影響LPL的表達(dá)。最后,利用生物信息學(xué)分析手段預(yù)測并比對不同物種間miR-10a-5p的序列、保守性及其靶標(biāo)基因,以此為基礎(chǔ)確定miR-10a-5p與TAK1存在結(jié)合位點,借助MicroRNA靶標(biāo)預(yù)測網(wǎng)站對兩者的結(jié)合自由能進(jìn)行評分。熒光素酶報告基因檢測miR-10a-5p與TAK1 3’UTR靶向結(jié)合情況,miR-10a-5p抑制劑轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞24小時,同時加入PC進(jìn)行處理,RT-PCR和Western Blot檢測相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)情況。[結(jié)果]RT-PCR,Western Blot和HPLC檢測發(fā)現(xiàn),PC處理的巨噬細(xì)胞中LPL mRNA及表達(dá)、總膽固醇、游離膽固醇,膽固醇酯的水平呈濃度和時間依賴性顯著降低;通過生物信息學(xué)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子ATF3與LPL的啟動子之間可能存在結(jié)合位點;熒光素酶報告基因和ChIP的結(jié)果表明,轉(zhuǎn)錄激活因子ATF3能夠增強(qiáng)LPL啟動子的活性,PC明顯抑制ATF3與LPL啟動子的結(jié)合;RT-PCR和Western Blot檢測發(fā)現(xiàn),PC減少ATF3 mRNA及表達(dá)并下調(diào)LPL mRNA及表達(dá),但當(dāng)過表達(dá)ATF3后,能夠逆轉(zhuǎn)PC對LPL的抑制作用,表明ATF3是參與調(diào)控LPL的關(guān)鍵因子。接下來檢測PC對JNK的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PC能夠抑制JNK的激活,并且在使用JNK激活劑茴香霉素處理后,恢復(fù)了ATF3與LPL mRNA及表達(dá);JNK是MAPK信號通路的另一亞類,其中TAK1是JNK的上游,進(jìn)一步檢測PC對TAK1的影響,結(jié)果顯示PC抑制TAK1 mRNA及表達(dá),并且在過表達(dá)TAK1后,JNK重新激活,ATF3與LPL mRNA及表達(dá)明顯恢復(fù)正常,證明PC通過TAK1/JNK/ATF3信號途徑抑制LPL的表達(dá);生物信息學(xué)分析提供的數(shù)據(jù)表明,miR-10a-5p在不同物種間高度保守,miR-10a-5p與TAK1結(jié)合具有種子序列且兩者的結(jié)合自由能較低,這些結(jié)果提示miR-10a-5p具有靶向結(jié)合TAK1 3’非翻譯區(qū)(3’UTR)的可能,通過TargetScan網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn),LPL 3’非翻譯區(qū)(3’UTR)與miR-10a-5p沒有結(jié)合位點。PC處理能夠明顯增加巨噬細(xì)胞內(nèi)miR-10a-5p的水平;熒光素酶報告基因檢測結(jié)果證實miR-10a-5p靶向結(jié)合TAK1 3’非翻譯區(qū)(3’UTR)。當(dāng)加入PC處理時,能夠明顯減少pJNK水平,以及TAK1、ATF3,LPL mRNA及表達(dá);但經(jīng)miR-10a-5p inhibitor處理后,恢復(fù)了pJNK水平,以及TAK1、ATF3,LPL mRNA及表達(dá)的促進(jìn)作用,表明miR-10a-5p參與了PC調(diào)控LPL表達(dá)及巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的過程。[結(jié)論]PC通過上調(diào)miR-10a-5p,抑制TAK1/JNK/ATF3信號通路,減少THP-1巨噬細(xì)胞LPL表達(dá)及脂質(zhì)蓄積。
【圖文】：

PC下調(diào)LPL的表達(dá)并減少巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積假說圖

不同濃度PC對巨噬細(xì)胞LPL表達(dá)及活性的影響
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R543.5

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本文編號：2611712