【摘要】：研究背景:慢性心力衰竭是多種心血管疾病的終末階段,其中常見的原因是冠心病,特別是心肌梗死。慢性心衰預后較差,有統(tǒng)計表明整體生存率比惡性腫瘤更低。患者的生存質(zhì)量逐年下降、醫(yī)療成本逐漸升高,引起社會的廣泛關注。水潴留是心衰的重要病理生理機制,針對水潴留的利尿是心衰規(guī)范化治療的基石。臨床上最常用的袢利尿劑能選擇性地阻斷分布在髓袢升支管腔側質(zhì)膜上的Na~+-K~+-2CI~-共轉運子,抑制機體對氯化鈉的重吸收,產(chǎn)生強大的利尿作用,但其應用也有一定的局限性。利鈉治療繼發(fā)的低鈉血癥是影響心衰遠期預后的危險因素,部分患者出現(xiàn)的利尿劑抵抗是臨床常見的難題。因此,新的水代謝調(diào)控靶點和高效安全、特異性強的利尿藥物研究一直是學術界關注的熱點。水通道蛋白2(Aquaporin 2,AQP2)分布于腎臟集合管主細胞的管腔頂質(zhì)膜和胞漿的囊泡內(nèi),是調(diào)控集合管水通透性的關鍵通道蛋白,主要承擔集合管腔水的重吸收和原尿濃縮的功能。AQP2在管腔頂質(zhì)膜的分布及合成上調(diào),進而增加水重吸收,是心力衰竭水潴留的最重要病理生理機制之一。針對調(diào)控AQP2蛋白開發(fā)的新型利尿劑顯示出眾多優(yōu)越性,具有廣闊的臨床應用前景。肥胖抑制素obestatin是2005年由斯坦福大學張鍵博士等人發(fā)現(xiàn)的一種由23個氨基酸構成的多肽,經(jīng)酰胺化修飾成為生物活性形式,在調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)功能、體重變化、糖脂代謝、血管內(nèi)皮功能等方面有廣泛作用。中樞側腦室給予obestatin可直接影響口渴中樞,減少機體的水攝入,同時通過抑制下丘腦的精氨酸加壓素(AVP)的合成和釋放,下調(diào)腎臟對水的重吸收。心力衰竭時外周循環(huán)obestatin水平升高,由于循環(huán)中obestatin不能通過血腦屏障進入中樞,那么外周循環(huán)obestatin對腎臟水重吸收是否有調(diào)節(jié)作用值得進一步研究。研究目的:目前在慢性心力衰竭機制研究中,關于obestatin和AQP2的作用鮮有報道。本課題旨在通過在體和體外實驗,觀察obestatin對水代謝和腎臟內(nèi)髓AQP2的長時調(diào)控作用,通過基因芯片篩選差異表達基因以及基因沉默技術來分析其可能的調(diào)控機制。研究方法:利用臨床常用器材,設計自制經(jīng)口氣管插管的定位防逆流裝置和尾靜脈穿刺用途的四聯(lián)固定器,并在預實驗中進行測試評估。采用開胸結扎前降支的方法構建大鼠急性心肌梗死模型,6周后通過心臟超聲來篩選EF值≤45%的大鼠作為心力衰竭模型,隨機納入造�？瞻捉M、dDAVP組、V2受體拮抗劑組、obestatin高劑量組、obestatin低劑量組、NA-obestatin組、obestatin抗血清組等7組,加上假手術組共8組。分別尾靜脈注射生理鹽水、dDAVP、OPC31260、obestatin(200ug/kg)、obestatin(100ug/kg)、NA-obestatin、obestatin抗血清,連續(xù)注射14天。第15天(造模后第8周末)為實驗終點并取大鼠腎臟內(nèi)髓。實驗全程定期測量尿量、體重,干預前后分別行心臟彩超檢查及留取血尿樣本。使用ELISA方法檢測血BNP和血AVP水平,使用熒光定量PCR檢測Aqp2基因表達,免疫組化和western blotting相對定量AQP2蛋白在腎臟內(nèi)髓的表達情況。體外培養(yǎng)mIMCD3細胞,待細胞長至70%融合狀態(tài),無血清培養(yǎng)基空白12h后,分別給予不同時間節(jié)點(6h、12h、24h、36h、48h,10~(-7)mmol/L的obestatin)和不同干預措施(PBS、10~(-7)mmol/L的obestatin、0.5×10~(-7)mmol/L的obestatin、NA-obestatin、dDAVP、OPC31260、obestatin抗血清)的刺激,24h后分別提取RNA和蛋白,通過定量PCR和western blotting來檢測AQP2基因和蛋白的表達水平。通過基因芯片對obestatin和PBS分別干預后的mIMCD3細胞mRNA進行差異表達基因篩查,通過生物信息學分析推測可能的調(diào)控機制并選取73個感興趣的基因進行real-time qPCR驗證。從驗證后的基因中選取與水代謝密切相關的Pparg、V2r、Gpr39三個靶基因進行特異性敲減,觀察obestatin調(diào)控AQP2表達的變化。結果:成功構建大鼠心梗后慢性心衰模型,成模率為51.16%。造模后8周,心衰模型各組間LVIDd、LVIDs、LVVold、LVVols、EF%、FS%等心功能指標以及血尿電解質(zhì)組間比較無明顯差異。Obestatin高劑量組與干預前相比24h尿量明顯增加(75.18±8.51 vs.40.77±5.49 mL/kg,P0.001)。Obestatin高劑量組與造�？瞻捉M相比,血漿BNP濃度明顯下降(1152.61±99.31 vs.1504.54±85.62 pg/mL,P0.001),血漿AVP無明顯變化(12.13±0.74 vs.12.41±1.04 pg/mL,P0.05)。Real-time qPCR及免疫組化、western blotting顯示腎內(nèi)髓AQP2基因和蛋白表達與造模空白組比較均下降。體外培養(yǎng)的IMCD3細胞經(jīng)obestatin在不同時間點刺激后,AQP2基因和蛋白的表達量水平波動基本一致,與對照組(0h)相比,6h、12h、24h、36h和48h時間點AQP2的表達量顯著降低(P0.05),在6h-24h區(qū)間內(nèi),隨著刺激時間的延長,其下降趨勢越明顯;但是36h后,其下降趨勢呈現(xiàn)回升現(xiàn)象。體外培養(yǎng)的mIMCD3細胞分別給予不同措施刺激24h后,與假手術組相比,obestatin高劑量組、obestatin低劑量組以及OPC組AQP2基因和蛋白的表達量顯著降低(P0.05),與obestatin高劑量組相比,抗血清組AQP2基因和蛋白的表達量顯著升高。在obestatin刺激后的mIMCD3細胞中表達差異有統(tǒng)計學意義的基因主要有Pparg、Aqp2、V2r、Fgf23、Myo1f、Slc8a1,可能參與長時調(diào)控的信號通路有FGF信號通路。敲減Pparg、V2r基因能使mIMCD3細胞的AQP2表達下調(diào),同時給予obestatin刺激24h后,下調(diào)幅度更為顯著。敲減Gpr39基因對mIMCD3細胞的AQP2表達無明顯影響,但同時給予obestatin刺激后,能顯著削弱obestatin對V2R、PPARG、AQP2的下調(diào)效應。結論:在體實驗和體外實驗證實了obestatin能下調(diào)腎臟內(nèi)髓AQP2表達,在體實驗還觀察到利尿作用及心衰的生化指標好轉�；蛐酒Y查結果的生物信息學分析及定量PCR驗證發(fā)現(xiàn)obestatin通過V2R與PPARG兩條信號通路來下調(diào)IMCD3細胞的Aqp2基因表達,Myo1f、Slc8a1基因可能參與鈣調(diào)蛋白結合和細胞骨架蛋白結合等分子生物學功能的調(diào)控。利用shRNA技術特異性敲減Pparg、V2r、Gpr39三個靶基因,在基因及蛋白水平證實了obestatin通過與GPR39受體相互作用來下調(diào)V2R、PPARG和AQP2的表達。
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設計可以利用臨床操作中常用的材料進行快速拼合，，分別使用 Intro管針，密閉式靜脈留置針。靜脈留置針可將金屬針芯適當截短，并傷聲門及氣道周圍組織。套管針的手持柄可以適度修剪，以便卡住大定住本裝置。各連接處可用膠布適當固定，便于重復使用（圖 1-2）圖 1-1 經(jīng)口氣管插管的定位評估防逆流裝置結構示意圖大體結構圖；B 氣泡筒縱截面圖；C 氣泡筒橫截面圖；1 插管；2 轉接頭；3 手；5 導氣管；6 開關；7 氣泡筒。

二、實驗方法（一）大鼠實驗相關器材的設計與制作1、實驗大鼠經(jīng)口氣管插管的定位評估防逆流裝置的設計與制作本實驗所涉及的定位評估防逆流裝置，包括插管、轉接頭、三通接頭、導氣管開關和氣泡筒，插管與轉接頭的前端連接，轉接頭的后端與三通接頭的第一端口連接三通接頭的第二端口連接呼吸機，導氣管的前端與三通接頭的第三端口連接、后端與氣泡筒連通，氣泡筒內(nèi)部設有橫截面呈圓形、縱截面呈梯形的圓臺狀氣流通道，氣流通道的孔徑小的端口與導氣管連通、孔徑大的端口為出泡口，導氣管上安裝有開關便于定位評估與呼吸機輔助通氣兩種工作狀態(tài)的切換（圖 1-1）。此設計可以利用臨床操作中常用的材料進行快速拼合，分別使用 Introcan Safet靜脈套管針，密閉式靜脈留置針。靜脈留置針可將金屬針芯適當截短，并打磨光滑以防刺傷聲門及氣道周圍組織。套管針的手持柄可以適度修剪，以便卡住大鼠上門齒從而固定住本裝置。各連接處可用膠布適當固定，便于重復使用（圖 1-2）。
【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R541.6

【參考文獻】

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本文編號：2603021