【摘要】：目的:研究miR-322在胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞定向分化中的作用與機制,miR-322通過何種途徑對胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化起到調(diào)控作用。本實驗以小鼠胚胎干細(xì)胞為研究對象,預(yù)測celf1為miR-322靶基因,利用慢病毒對miR-322、celf1進(jìn)行過表達(dá)與敲減,研究miR-322、celf1在胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的定向分化的作用、以及二者間的相互影響。我們希望通過本研究的深入,為心肌損傷臨床防治提供新思路、新靶點和新方向,為miR-322在心血管疾病中甚至更多其他疾病的應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)與治療方法。方法:1、MEF細(xì)胞與mES-D3細(xì)胞的傳代培養(yǎng):MEF細(xì)胞傳代于P3代以Mitomycin C處理。在以MEF細(xì)胞為飼養(yǎng)層的條件下,使mES-D3細(xì)胞穩(wěn)定傳代。2、慢病毒載體的制備,慢病毒轉(zhuǎn)染。將攜帶目的基團(tuán)與抗性篩選基因、熒光基團(tuán)的質(zhì)粒裝載進(jìn)入慢病毒中,并預(yù)先測得的最佳轉(zhuǎn)染條件,將病毒轉(zhuǎn)染mES-D3細(xì)胞;之后經(jīng)過抗性篩選,提高轉(zhuǎn)染效率。3、mES-D3細(xì)胞分5組進(jìn)行分化。將細(xì)胞分成5組:(1)過表達(dá)miR-322與野生細(xì)胞、空病毒組;(2)敲減miR-322與野生細(xì)胞、空病毒組;(3)過表達(dá)celf1與野生細(xì)胞、空病毒組;(4)敲減celf1與野生細(xì)胞、空病毒組;(5)miR-322、celf1同時過表達(dá)與野生細(xì)胞、空病毒組。通過經(jīng)典的hanging drop的方法形成擬胚體(embryoid body),建立分化模型,并于分化開始后不同時間點進(jìn)行樣品收集。4、以western blot的方式進(jìn)行抗體與免疫測定。按常規(guī)方法將蛋白樣品轉(zhuǎn)移至NC膜上。先后用Nkx-2.5、Celf1單克隆兔抗,GAPDH、cTnT鼠抗孵育及辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗進(jìn)行孵育,增強熒光試劑顯色。測定各實驗組mES-D3細(xì)胞中celf1的表達(dá),以驗證病毒轉(zhuǎn)染是否成功,再于各分化模型中第0,5,10天測定GAPDH、Nkx-2.5、cTnT。5、qRT-PCR分析。以各基因組D0天的EB表達(dá)水平作為標(biāo)準(zhǔn)對照,測定Oct-4、Sox-2、Nkx-2.5、MLC-2v、α-MHC、c TnT等基因在mES-D3細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化中的變化。提取總RNA,將總RNA進(jìn)行rt-PCR逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,cDNA于ABI公司7500熒光定量PC R儀中反應(yīng),待反應(yīng)結(jié)束進(jìn)行擴(kuò)增曲線及溶解曲線計算,計算出2-△△Ct值,使用GraphPad Prism 5分析數(shù)據(jù)。6、免疫熒光(immunofluorescence)觀察mES-D3細(xì)胞分化后的心肌細(xì)胞分布。將EB種板后,在固定天數(shù)將其洗滌、固定,在熒光下觀察各組α-actinin的表達(dá)。結(jié)果:1、miR-322在心肌發(fā)育過程中起到關(guān)鍵作用(1)上調(diào)miR-322會顯著促進(jìn)心肌細(xì)胞的分化;(2)下調(diào)miR-322會抑制心肌細(xì)胞分化并影響心肌細(xì)胞成熟。2、Celf1是心肌發(fā)育中一個關(guān)鍵性的調(diào)控因素(1)Celf1的過表達(dá)將會使心肌細(xì)胞的分化受到抑制;(2)對celf1基因敲減,發(fā)現(xiàn)對心肌細(xì)胞發(fā)育有正向調(diào)節(jié)作用。3、Celf1是miR-322調(diào)控心肌分化的下游靶基因(1)在miR-322過表達(dá)實驗組,celf1敲減實驗組與miR-322、celf1同時過表達(dá)實驗組,celf1(CUG-BP1)的表達(dá)有不同程度的下調(diào)。(2)miR-322、celf1同時過表達(dá)實驗組的結(jié)果與celf1單獨過表達(dá)實驗組心肌標(biāo)記物檢測結(jié)果很相近。結(jié)論(1)miR-322對胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化有促正性調(diào)節(jié)作用。(2)Celf1對胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化有負(fù)性調(diào)節(jié)作用。(3)miR-322通過抑制Celf1表達(dá)來達(dá)到促進(jìn)心肌細(xì)胞分化的作用。
【圖文】：

使用hangingdrop的方式將ES細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的實驗方法展示培養(yǎng)方法

3.1.5 目的基因轉(zhuǎn)染后，mESC-D3 細(xì)胞表型轉(zhuǎn)染慢病毒后，，用倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)在 miR-322 過表達(dá)組，celf1 過表達(dá)組，miR-322、celf1 同時過表達(dá)組與其他組相比，胚胎干細(xì)胞集落更小，成團(tuán)率更低，細(xì)胞趨于貼壁生長。用熒光顯微鏡拍照攜帶病毒質(zhì)粒的 mESC-D3 發(fā)強烈的綠色熒光（圖 4）。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R54

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 余樹民;王晗;竇忠英;;絲裂霉素C處理后鼠胚成纖維細(xì)胞活力分析[J];西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2007年05期

2 楊恕玲;董雅娟;柏學(xué)進(jìn);李建棟;程明;;小鼠MEF的制備及ES細(xì)胞的分離培養(yǎng)試驗[J];萊陽農(nóng)學(xué)院學(xué)報;2005年04期

本文編號：2587325