本文關(guān)鍵詞：miR-29a-3p對高血壓腦卒中的發(fā)生發(fā)展所起作用的初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：動脈粥樣硬化是世界范圍內(nèi)致死致殘的首要原因,其血管損害進程由早期的脂肪條紋逐漸進展為粥樣斑塊。動脈粥樣硬化的病理機制是循環(huán)系統(tǒng)中炎癥因子和多種血管壁內(nèi)細胞(內(nèi)皮細胞、單核細胞、淋巴細胞、血管平滑肌細胞)復(fù)雜的交互作用的結(jié)果,其特征性表現(xiàn)為動脈內(nèi)膜變厚、炎癥細胞和血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)積累以及細胞外脂質(zhì)和纖維素沉積。近年來,不斷累積的研究證據(jù)表明,在動脈粥樣硬化斑塊的初始期、進展期和最終破裂時期,血管平滑肌細胞的結(jié)構(gòu)和功能是不同的。血管平滑肌細胞擁有顯著的可塑性,能夠可逆的后天發(fā)育的表型。內(nèi)皮細胞功能異常、機械或血流動力學(xué)壓力以及炎癥引起的血管損傷,促使血管平滑肌細胞從一種正常的、靜止的、有收縮性的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N活躍合成的表型,控制收縮功能的基因收到抑制,促進增殖、遷移、炎癥的基因被誘導(dǎo),導(dǎo)致大量的細胞外基質(zhì)、細胞因子和蛋白酶合成。除了大量的增殖和遷移外,合成型的血管平滑肌細胞表達大量的極低密度脂蛋白、低密度脂蛋白和清道夫受體,這些促進了不正常的脂質(zhì)攝取和泡沫細胞形成,最終動脈粥樣硬化開始形成。由于血管平滑肌細胞表型調(diào)控在動脈粥樣硬化損害的起始、進展以及最后破裂非常重要,尋找促進其以上轉(zhuǎn)變的分子靶點可能為動脈粥樣硬化的治療提供新的方法,以最終較少腦卒中的發(fā)生率。血管生成是動脈粥樣硬化過程中一個顯著的特征,內(nèi)膜的血管新生更多的來自于鄰近斑塊的動脈外膜稠密血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),而不是主要血管內(nèi)膜新生血管在斑塊代謝活動中扮演了活躍的角色,使其生長超出了動脈內(nèi)腔擴散的關(guān)鍵限值。隨后,新生血管的固有弱點導(dǎo)致動脈斑塊內(nèi)出血以及不穩(wěn)定性增加。通過對有癥狀的病人血管內(nèi)膜切除術(shù)后進行組織學(xué)抗CD34染色,表明新增的血管分布和斑塊內(nèi)出血有很強的相關(guān)性。這些新生血管形成的不規(guī)則性表明其與正常組織創(chuàng)傷修復(fù)的血管新生是不同的。斑塊相關(guān)內(nèi)皮細胞活躍,伴隨著單核細胞和巨噬細胞的增多以及粘附因子的表達增加,他們至少部分誘導(dǎo)了斑塊形成過程中的炎癥反應(yīng)。動脈粥樣硬化病變中細胞成分的凋亡增加了脂質(zhì)體的形成,使纖維帽變薄,減少了間質(zhì)膠原纖維的聯(lián)系(由于平滑肌細胞的凋亡),產(chǎn)生有漏洞的微血管(內(nèi)皮細胞的凋亡),最終導(dǎo)致斑塊破裂及斑塊內(nèi)出血。microRNAs微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一組小的非編碼RNA(20-25個核苷酸),它們對轉(zhuǎn)錄后基因的表達、調(diào)控以及多重信號通路(包過細胞分化、增殖、平衡以及器官發(fā)育)的整合非常重要。微小核糖核酸是高度保守的非編碼RNA,他通過調(diào)節(jié)基因表達的抑制,最終抑制蛋白質(zhì)的翻譯。他們通過平衡細胞的增殖和分化在腫瘤生成和器官發(fā)育的細胞進程的起到關(guān)鍵調(diào)控作用成熟的微小RNA結(jié)合到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體中,復(fù)合體引導(dǎo)到微小RNA與目標的信使RNA (mRNA)結(jié)合,最終抑制其翻譯為蛋白質(zhì)。到2012年,已有超過600人類]microRNA被發(fā)現(xiàn),這些nicroRNA參與的大約50%人類編碼蛋白的調(diào)控。據(jù)估計,人類基因組中1%到4%是microRNA,而一條microRNA能調(diào)控多達200個mRNA。一條microRNA有能力調(diào)控多個基因是由于它能以不完全的或完全的配對結(jié)合的mRNA的對應(yīng)靶點上。越來越多的證據(jù)表明microRNA在許多重要的生物學(xué)進程中扮演著關(guān)鍵作用,例如細胞生長、器官分化、細胞增殖、胚胎發(fā)育、凋亡、細胞信號網(wǎng)絡(luò)通路、不同物種基因表達變化以及轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。COL1A2COL1A2是編碼I型膠原α2鏈的基因,在大多數(shù)結(jié)締組織中均存在此膠原纖維。在這個基因的突變與成骨不全癥,Ehlers-Danlos綜合征,特發(fā)性骨質(zhì)疏松癥,和非典型馬凡綜合征緊密相關(guān)。但是,此基因的突變相關(guān)的癥狀往往比在基因α-1型突變的Ⅰ型膠原相對較輕,因為a-2是低豐度。這個基因的多重信號由多聚腺苷酸化信號引發(fā),這個特征和大多數(shù)其他膠原蛋白基因一樣。血管壁同時含有Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白,這兩種膠原蛋白在維持血管壁的完整性、可塑性以及抗壓性中發(fā)揮有重要作用。多年前就有研究表明,在顱內(nèi)動脈血管壁的構(gòu)成中,Ⅰ型膠原蛋白與彈性纖維相伴隨分布于平滑肌細胞的表面,說明Ⅰ型膠原蛋白在保證顱內(nèi)血管壁的完整性及可塑性方面發(fā)揮更重要的作用。在人體的多種組織中,尤其是血管壁,可以發(fā)現(xiàn)Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白同時表達,而且兩種膠原蛋白可形成特異性的纖維。血管壁的彈性通常與Ⅲ型膠原蛋白和Ⅰ型膠原蛋白的構(gòu)成比例有關(guān),一般來說,當(dāng)Ⅰ型膠原蛋白所占比例升高后,兩種構(gòu)成的膠原纖維將會增粗,血管壁的彈性將會下降,從而容易引起血管瘤的形成或者血管的破裂。KLF4Kruppel樣因子4(KLF4)是轉(zhuǎn)錄因子Kruppel樣因子家族的一員,它在增殖、分化、凋亡以及體細胞的重編程中扮演了重要角色,有證據(jù)表明,klf4同時還是某些癌癥的腫瘤抑制因子,例如大腸癌。在胚胎干細胞中,klf4已被證明是一種良好的干細胞樣能力的標志物,在骨髓間充質(zhì)干細胞中,也同樣能作為標志物。以往的研究發(fā)現(xiàn),klf4對動脈粥樣硬化炎癥進程具有促進和抑制的雙向調(diào)控作用：一方面血管內(nèi)皮細胞klf4的過度表達會促進多種抗炎抗血栓因子表達,例如如內(nèi)皮細胞型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)、血栓調(diào)節(jié)蛋白,從而產(chǎn)生抗炎、抗血栓的作用；另一方面klf4的過度表達能激活一系列促進炎癥的細胞因子表達增加,例如腫瘤壞死因子,IL-10L、趨化因子CXCL5,單核細胞集落刺激因子(granulo-cyte colony-sfimuhting factor, GCSF)等,從而起到促進炎癥加速動脈粥樣硬化的作用。本研究自2013年1月起,我們研究組利用基因芯片技術(shù)已對高血壓腦卒中miRNAs表達譜進行了初步分析,篩選出差異表達miRNAs,證實這是一個可行的研究方法。本研究主要內(nèi)容包括兩部分：第一部分,利用基因芯片技術(shù)研究高血壓腦卒中患者血漿與一般高血壓患者血漿中差異性miRNAs表達譜,篩查差異性表達的MiRNAs,并進行RT-PCR驗證基因芯片分析的結(jié)果。第二部分：使用相關(guān)軟件對經(jīng)篩查差異表達的miRNA的下游靶基因進行預(yù)測,并使用RT-PCR進行基因表達量的半定量分析驗證篩選出來的靶基因。實驗?zāi)康模?研究高血壓腦卒中患者血漿與高血壓患者血漿中差異性miRNAs表達譜,篩查差異表達的miRNAs。2預(yù)測差異表達的miRNA下游的靶基因,并初步驗證靶基因表達。實驗內(nèi)容與方法。1血漿樣本的采集和儲存2采用Norgen血漿/外泌體RNA提取試劑提取血漿總RNA。3采用microRNA芯片篩選出病例組、對照組血漿特異性miRNAs,采用相關(guān)軟件和統(tǒng)計學(xué)方法將得到的miRNA表達譜數(shù)據(jù)進行分析。4 RT-PCR驗證血漿中差異表達的miRNA.5登入互聯(lián)網(wǎng)使用miRNA靶基因預(yù)測軟件MiRanda、Targetscan、Pictar,預(yù)測差異表達miRNA的靶基因,并根據(jù)基因功能進行篩選。6 RT-PCR驗證以上預(yù)測的靶基因。實驗結(jié)果：1. miRNAs基因芯片篩選出9個差異性表達的miRNAs,在腦卒中病人中其中6條表達下降,3條表達升高。3個上調(diào)的miRNAs中無上調(diào)超過2倍(即Log2 (G1/G2)≥1)的miRNAs;下調(diào)大于2倍(Log2 (G1/G2)≤(-1))的hsa-miRNAs有3個:hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-3 Oc-5p、hsa-miR-5195-3p,其中以has-miR-29a-3p下調(diào)倍數(shù)最大。2基因芯片RT-PCR驗證結(jié)果中,hsa-miR-29a-3p下調(diào)倍數(shù)超過2倍,hsa-miR-30c-5p和hsa-miR-5195-3p下調(diào)倍數(shù)未超過2倍,但是上升下調(diào)的趨勢與芯片結(jié)果保持相同,提示RT-PCR結(jié)果與芯片結(jié)果大體保持一致,其中以hsa-miR-29a-3p可靠性最高。3生物信息學(xué)分析結(jié)果篩選出hsa-miR-29a-3p下游103個可疑的靶基因,通過查閱文獻中相關(guān)基因功能,選取了COL1A2和klf4兩個與本研究緊密相關(guān)的基因。4靶基因RT-PCR驗證結(jié)果,兩組兩基因的CT值分別采用2-△△Ct方法進行數(shù)據(jù)分析,結(jié)果顯示病例組明顯較對照組降低(P0.05),即病例組樣本中COL1A2和klf4兩基因的初始量較對照組高,兩組之間有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗結(jié)論：1高血壓人群中發(fā)生腦卒中的病人與未發(fā)生腦卒中的人員血漿miRNAs表達譜存在差異,我們共發(fā)現(xiàn)9條有差異性表達的miRNAs,在腦卒中病人中其中6條表達下降,3條表達升高。2在miRNAs表達譜中,miR-29a-3p的改變最為顯著,它可以作為分子生物學(xué)標志用來篩查高血壓患者中易發(fā)生腦卒中的高危人群,同時miR-29a-3p可能參與了高血壓患者腦卒中發(fā)生發(fā)展的病理過程。3腦卒中患者中miR-29a-3p表達量下降,可能減少了對其下游靶基因COL1A2的抑制,從而使后者表達增加,使顱內(nèi)動脈血管壁的I型膠原蛋白所占比例升高,從而引起膠原纖維增粗、血管壁彈性降低,進而引起血管的破裂出血。4腦卒中患者中miR-29a-3p表達量下降,可能減少了對其下游靶基因klf4的抑制,從而使后者表達增加,其表現(xiàn)以促進炎癥作用為主,誘導(dǎo)TNF、IL-10L、趨化因子CXCL5、單核細胞集落刺激因子等炎癥介質(zhì)產(chǎn)生,從而加速動脈粥樣硬化進程。
【關(guān)鍵詞】：微小RNA 腦梗死 腦出血 miRNAs芯片 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng) Ⅰ型膠原α2鏈 Kruppel樣因子4
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R544.1;R743.3
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 第1章 研究背景17-20
• 第2章 microRNA微陣列技術(shù)研究腦卒中患者microRNA的差異表達譜及RT-PCR驗證20-41
• 2.1 材料與方法21-33
• 2.1.1 標本資料21-22
• 2.1.2 標本收集及處理22
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備及試劑22-23
• 2.1.4 實驗方法23-33
• 2.2 實驗結(jié)果33-38
• 2.2.1 血漿中提取的RNA質(zhì)量檢測33-35
• 2.2.2 差異性表達基因的篩查結(jié)果35-36
• 2.2.3 對篩選出的差異miRNA進行PCR驗證結(jié)果36-38
• 2.3 結(jié)果討論與小結(jié)38-41
• 第3章 miR-29a-3p靶基因生物信息學(xué)預(yù)測分析及RT-PCR初步驗證41-61
• 3.1 材料與方法42-50
• 3.1.1 試劑42-43
• 3.1.2 儀器43
• 3.1.3 實驗步驟43-50
• 3.2 實驗結(jié)果50-57
• 3.2.1 靶基因預(yù)測結(jié)果50-53
• 3.2.2 mRNA引物設(shè)計及驗證53-55
• 3.2.3 RNA質(zhì)量檢測55
• 3.2.4 靶基因RT-PCT驗證55-57
• 3.3 實驗結(jié)果討論與小結(jié)57-61
• 第4章 研究結(jié)論61-63
• 參考文獻63-66
• 中英文略縮詞對照表66-67
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果67-68
• 致謝68-69

【共引文獻】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 李天佳;煙霧萃取劑和氧化應(yīng)激對血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞增殖的影響[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

2 張赫男;環(huán)孢素A對冠心病及再狹窄免疫機制的干預(yù)研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2013年

  本文關(guān)鍵詞：miR-29a-3p對高血壓腦卒中的發(fā)生發(fā)展所起作用的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：258457