發(fā)布時間：2020-02-24 02:25

【摘要】：背景： 尿素通道B（Urea Transporter B, UT-B）是介導尿素快速跨膜轉(zhuǎn)運的膜通道蛋白，在腎臟、心臟、腦等多種組織表達。前期工作發(fā)現(xiàn)UT-B基因敲除可導致小鼠血清、心臟尿素水平增高，16周齡時發(fā)生心臟傳導阻滯，在老齡時左室重構、心臟功能下降、間質(zhì)纖維組織增生。左室心肌差異蛋白組學結(jié)果表明，UT-B基因敲除小鼠糖酵解和脂肪酸β氧化關鍵酶表達明顯異常。因此提出UT-B缺失使細胞內(nèi)尿素堆積導致心肌能量代謝異常，引起心肌肥大的假說。本研究擬觀察UT-B基因敲除小鼠在增齡負荷（52周齡）及壓力負荷（16周齡腹主動脈縮窄4周）后心臟的形態(tài)學改變，，與野生型小鼠之間進行對比，探討UT-B基因敲除小鼠對心肌肥大的易感性，檢測16周和52周UT-B基因敲除小鼠心肌葡萄糖氧化、脂肪酸氧化和糖酵解水平及線粒體功能，與野生型小鼠進行差異對比分析，進而驗證上述假說，揭示心肌代謝重構在UT-B敲除導致小鼠發(fā)生心肌肥大中的作用機制，尋找防治心肌肥大的新的靶點。 1. UT-B基因敲除小鼠在慢性應激負荷時更容易發(fā)生心肌肥大 對52周齡的UT-B基因敲除小鼠的心臟形態(tài)學變化進行系列研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)心臟重量增加，細胞直徑增大，間質(zhì)纖維化，發(fā)生明顯心肌肥大。心臟組織MDA水平增加(p0.05)、SOD蛋白表達和活性下降(p0.05)，ANP表達增加(p0.05)，電鏡結(jié)果顯示心肌線粒體腫脹、脂滴增加，提示脂肪代謝障礙、氧化應激水平增加可能參加其發(fā)病機制。 對16周齡和野生型小鼠實施腹主動脈縮窄手術，結(jié)果表明慢性壓力負荷時，UT-B缺失也加速了心肌肥大的進程，心肌細胞活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平也明顯增加(p0.05)，進一步證明UT-B基因敲除后小鼠在慢性負荷時容易發(fā)生心肌肥大。 2.16周齡UT-B基因敲除小鼠心肌細胞糖、脂代謝和線粒體功能的改變 通過PCR array糖代謝芯片檢測UT-B敲除小鼠心肌組織糖酵解關鍵酶mRNA表達，發(fā)現(xiàn)多個關鍵酶表達上調(diào)(p0.05)，而部分三羧酸循環(huán)關鍵酶下調(diào)(p0.05)。Western blot方法檢測糖酵解關鍵酶烯醇化酶(α-enolase, ENOα)蛋白的表達明顯增加(p0.05)。熒光探針標記法檢測心肌細胞酸度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)H+明顯增加(p0.05)。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)UT-B基因敲除小鼠心肌組織中脂肪酸氧化關鍵酶脂酰輔酶A脫氫酶(acyl-CoA dehydrogenase, ACAD)和重要調(diào)節(jié)因子過氧化物酶體增殖物激活型受體α (peroxisome proliferator activated receptors α, PPARα)表達水平明顯低于野生型小鼠。以上提示UT-B基因敲除后由于小鼠心肌細胞尿素轉(zhuǎn)運異常，而導致糖、脂代謝異常，可能是心肌肥大易感性增加的主要原因。 應用Nanoscale LC MS/MS分析16周UT-B基因敲除小鼠心肌線粒體差異蛋白的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)50種蛋白發(fā)生明顯調(diào)變，包括線粒體電子傳遞鏈復合體I，III，IV和V相關亞基和清除氧自由基相關酶隨齡明顯下降(p0.05)；復合體I和IV活性明顯下降(p0.05)， ATP含量降低(p0.01)，線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)發(fā)生突變。應用流式細胞術檢測UT-B基因敲除小鼠心肌ROS水平和線粒體ΔΨm水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ROS水平明顯增加(p0.01)，ΔΨm明顯減低(p0.05)。以上結(jié)果說明UT-B基因敲除小鼠線粒體功能明顯異常。 應用質(zhì)譜分析16周UT-B基因敲除小鼠心肌L-精氨酸含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含量明顯下降(p0.05)，試劑盒檢測NO含量減少(p0.05)，內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)、精氨酸酶1（arginase1， Arg1）和精氨酸代琥珀酸合成酶1（Argininosuccinate synthetase1， Ass1）的蛋白表達明顯下降(p0.05)，結(jié)果說明尿素循環(huán)發(fā)生障礙，可能通過影響尿素循環(huán)對三羧酸循環(huán)的底物供給而影響三羧酸循環(huán)。 3.52周齡UT-B基因敲除小鼠心肌細胞糖、脂代謝和線粒體功能的改變 應用Nanoscale LC MS/MS分析發(fā)現(xiàn)，在16周小鼠中發(fā)生調(diào)變的線粒體電子傳遞鏈復合體相關亞基和清除氧自由基相關酶等在52周UT-B基因敲除小鼠心臟的表達水平明顯下降(p0.05)；糖代謝關鍵酶丙酮酸脫氫酶b (pyruvatedehydrogenase b, PDHb)明顯增加，異檸檬酸脫氫酶2（isocitrate dehydrogenase2,IDH2）表達下降(p0.05)，而脂肪酸氧化關鍵酶ACAD(s)和重要調(diào)節(jié)因子PPARα表達水平明顯低于野生型小鼠(p0.05)。說明UT-B基因敲除后小鼠心肌細胞的糖脂代謝異常隨齡持續(xù)存在并加劇，可能為其氧化應激水平增加、心肌肥大的主要原因。 綜上所述，UT-B基因敲除小鼠尿素蓄積導致心肌細胞尿素循環(huán)障礙，繼而導致線粒體三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid, TCA)受阻，能量供應減少，線粒體功能障礙，糖、脂底物利用途徑改變，發(fā)生代謝重構，氧化應激水平增加，促進小鼠發(fā)生心肌肥大。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R542.2

【共引文獻】

相關期刊論文 前10條

1 羅廣平;汪傳喜;夏文杰;葉欣;吐爾洪;王軍;孔慶芳;

本文編號：2582324