【摘要】：目的:人肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(Human liver fatty acid binding protein,FABP1)是一組分子量約為14~15KD,并能與長鏈脂肪酸結(jié)合的高保守性蛋白,是脂肪酸結(jié)合蛋白家族成員之一。本實驗室前期研究表明肝細(xì)胞核因子3β(hepatocyte nuclear factor 3β,HNF3β)和CCAAT/增強(qiáng)結(jié)合蛋白α(CCAAT/enhancer binding proteinα,C/EBPα)作用于FABP1基因的啟動子調(diào)控其表達(dá),但是3’末端非翻譯區(qū)(3’untranslational region,3’UTR)的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究旨在深入探討mi RNA對FABP1-3’UTR表達(dá)的影響,從而深入探討肝細(xì)胞脂肪化的機(jī)制,有助于為脂肪肝的診斷治療提供新的診治方向。方法:1.運用PicTar、Target Scan等軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析FABP1相關(guān)的mi RNAs,篩選出可能靶向FABP1-3’UTR的mi RNAs。2.化學(xué)合成FABP1-3’UTR,連接于pmir GLO載體,構(gòu)建重組載體pmir GLO-FABP1-3’UTR,通過脂質(zhì)體介導(dǎo)將軟件預(yù)測的mi RNA mimics或陰性對照(Negative Control,NC)與pmir GLO-FABP1-3’UTR重組載體分別共轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染48 h后,通過雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)進(jìn)行熒光素酶活性檢測,與對照組相比,篩選出可能作用于FABP1-3’UTR的mi RNAs。3.找到初步篩選出來的mi RNAs與FABP1-3’UTR的配對堿基,突變配對堿基,化學(xué)合成pmir GLO-FABP1-3’UTRmuts,由脂質(zhì)體介導(dǎo)與相應(yīng)mi RNA mimics共轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞,48h后,通過雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)進(jìn)行熒光素酶活性檢測,進(jìn)行復(fù)篩。4.進(jìn)一步采用熒光定量PCR和western-blot方法檢測mi RNAs對FABP1 m RNA和蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果:通過軟件預(yù)測及數(shù)據(jù)庫分析,篩選出68條可能靶向FABP1-3’UTR的mi RNAs。將以上篩選出mi RNA mimics與pmir GLO-FABP1-3’UTR重組載體分別共轉(zhuǎn)入Hep G2細(xì)胞,48h后,與對照組相比,熒光素酶活性檢測顯示有16個mi RNAs能明顯降低熒光素酶值(t檢驗分析,P0.05)。且在復(fù)篩中發(fā)現(xiàn),其中6個mi RNAs相對應(yīng)的突變體能夠回復(fù)這種下調(diào)作用,即有6個mi RNAs能夠下調(diào)FABP1-3’UTR的表達(dá),分別為:mi R-323a-3p、mi R-362-3p、mi R-4672、i R-466、mi R-3941、mi R-4517。以GAPDH為realtime逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)內(nèi)參,實驗結(jié)果表明部分mi RNAs對FABP1在mRNA表達(dá)水平?jīng)]有影響甚至上調(diào),部分下調(diào)FABP1的表達(dá):mi R-323a-3p、mi R-362-3p、mi R-4672。以β-actin為western blot內(nèi)參,結(jié)果顯示mi RNAs均能夠不同程度的下調(diào)FABP1蛋白水平表達(dá)。結(jié)論:6個mi RNAs能通過作用于FABP1的3’UTR在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控FABP1基因的表達(dá),影響FABP1的正常表達(dá),導(dǎo)致一系列生理病理變化。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R542.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2566496