【摘要】：[目的]VSMC遷移是動(dòng)脈粥樣硬化和血管術(shù)后內(nèi)膜增生再狹窄病理進(jìn)程的關(guān)鍵性階段。傳統(tǒng)體外細(xì)胞研究模型的局限性制約了VSMC生長微環(huán)境的表征,同樣降低了VSMC受調(diào)控作用的研究可信證據(jù)級別。本研究擬采用微流控技術(shù)在體外重建VSMC增殖、遷移微環(huán)境,并進(jìn)一步引入高通量劃痕遷移表征不同類型VSMC在不同種類／不同濃度化學(xué)誘導(dǎo)物條件影響下的遷移現(xiàn)象。與既往文獻(xiàn)報(bào)道和傳統(tǒng)研究方法獲得的結(jié)論進(jìn)行比較,解析細(xì)胞生長微環(huán)境變化對VSMC增殖、遷移的影響。有望在新細(xì)胞微環(huán)境平臺(tái)上,通過對VSMC相關(guān)功能和機(jī)制開展更為深入的研究,為再狹窄防治開拓新的思路和方案。[方法]1.基于微流控技術(shù)體外重建VSMC增殖微環(huán)境,通過重力作用實(shí)現(xiàn)微溝道內(nèi)不同襯底基質(zhì)修飾(玻璃表面、多聚賴氨酸、纖連蛋白、膠原蛋白)、VSMC注入、長期培養(yǎng)和平滑肌肌動(dòng)蛋白α-actin免疫染色。2.基于微流控技術(shù)體外重建VSMC遷移微環(huán)境,通過重力作用實(shí)現(xiàn)微溝道內(nèi)VSMC主入、培養(yǎng)、劃痕遷移,并定量分析不同芯片尺寸(微溝道高度100μm vs.250 μm,芯片厚度2mm vs.8mm)、不同襯底基質(zhì)修飾(纖連蛋白vs.膠原蛋白)、不同細(xì)胞因子(無FBS,10%FBS,10%FBS+PDGF-BB, 10%FBS+TNF-a)、不同類型VSMC(人主動(dòng)脈VSMC細(xì)胞系,人主動(dòng)脈原代VSMC,鼠主動(dòng)脈原代VSMC,正常內(nèi)乳動(dòng)脈原代VSMC,主動(dòng)脈夾層病變部位原代VSMC)等條件下細(xì)胞遷移距離,比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3.基于微流控技術(shù)可控性好、精度高等優(yōu)點(diǎn),通過電調(diào)控表面襯底,實(shí)現(xiàn)高通量實(shí)時(shí)研究細(xì)胞遷移,并定量分析不同類型VSMC (人主動(dòng)脈VSMC細(xì)胞系,頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊部位原代VSMC),在不同細(xì)胞因子濃度梯度(FBS, PDGF-BB, TNF-α, AngⅡ)下遷移距離,總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,探索個(gè)中規(guī)律。4.對每次拍照后的VSMC在Image Pro Plus 6.0圖像處理軟件中人工測量,兩人背靠背,取平均值,用Microsoft 2007 excel軟件錄入并統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組問均數(shù)比較采用ANOVA檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)為a=0.05(或0.01)代表組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(或高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。[結(jié)果]1.通過重力作用實(shí)現(xiàn)了微溝道內(nèi)襯底基質(zhì)修飾,VSMC注入、長期培養(yǎng)、觀察和細(xì)胞免疫染色。經(jīng)過參數(shù)優(yōu)化,實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞在微溝道內(nèi)的均勻分布(96.0±16.3/mm2)。與玻璃裸表面相比,細(xì)胞外基質(zhì)(膠原蛋白、多聚賴氨酸、纖連蛋白)修飾的襯底在某個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)范圍內(nèi)可以促進(jìn)VSMC的增殖和表型改變。2.比較不同的芯片幾何尺寸、襯底表面修飾、細(xì)胞因子對VSMC遷移的影響,結(jié)果表明,1)微溝道高度對細(xì)胞遷移有顯著作用;2)與纖連蛋白相比,片上修飾膠原蛋白更能促進(jìn)細(xì)胞遷移;3)FBS、PDGF-BB、TNF-α均能促進(jìn)細(xì)胞遷移。另外,還量化了五種類型VSMC(人VSMC細(xì)胞系、人和鼠原代VSMC、兩例患者樣本分離培養(yǎng)得到的原代VSMC)的遷移能力,發(fā)現(xiàn)人細(xì)胞系和患者樣本的細(xì)胞遷移距離可比擬,但是顯著少于人和鼠原代細(xì)胞。3.基于高通量、可控性好的384孔劃痕遷移方法,結(jié)果表明,1)隨著FBS濃度升高,VSMC遷移距離增加,證實(shí)該大序列劃痕遷移技術(shù)的可行性；2)隨著PDGF-BB農(nóng)度升高,人VSMC細(xì)胞系遷移距離增加,但是沒有飽和的趨勢;3)隨著PDGF-BB農(nóng)度升高,產(chǎn)生遷移的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊部位原代VSMC個(gè)數(shù)上升,并在200ng/ml的位置出現(xiàn)峰值,之后又開始下降;4)隨著TNF-α濃度升高,產(chǎn)生遷移的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊部位原代VSMC個(gè)數(shù)無明顯變化;5)隨著AngⅡ濃度升高,產(chǎn)生遷移的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊部位原代VSMC個(gè)數(shù)有下降趨勢。[結(jié)論]1.基于微流控技術(shù)體外重建VSMC增殖微環(huán)境,該新型平臺(tái)技術(shù)開發(fā)了VSMC研究系列中新的VSMC培養(yǎng)模式。2.基于微流控技術(shù)體外重建VSMC遷移微環(huán)境,該新型平臺(tái)技術(shù)開發(fā)了VSMC研究系列中新的VSMC遷移模型。3.基于微流控技術(shù)實(shí)現(xiàn)VSMC大序列劃痕遷移,該新型平臺(tái)技術(shù)開發(fā)了一種高通量,自動(dòng)化,適于實(shí)時(shí)觀察分析的研究模型。
【圖文】：

養(yǎng)微溝道陽模的方形塑料皿內(nèi)：真空腔室抽氣３０分鐘Ｗ上，觀察表面，直至沒逡逑有氣泡為止；放入烘箱？調(diào)平，加熱ＰＤＭＳ使之固化（８０°邋Ｃ，至少１０小時(shí)），逡逑如圖２中子圖ＩＶ所示。逡逑ＰＤＭＳ模具剝離、清洗：將ＰＤＭＳ從方形皿中取出，然后將ＰＤＭＳ從玻片逡逑上剝離，并將玻片背面的巧巧撕下來尲在正面，防止溝道內(nèi)落入灰塵：沿著玻片逡逑印跡切出長方形器件，，邊緣切割整齊，表面平整，使其小于玻片，邊緣突起也要逡逑切掉；使用直徑４ｍｍ打孔器對準(zhǔn)器件上的圓形注入孔打孔（器件的溝道面朝上，逡逑下面墊上一層厚無塵紙），使完全洞穿，拔掉孔內(nèi)ＰＤＭＳ；透明膠帶粘貼ＰＤＭＳ逡逑器件表面１０次，清除雜質(zhì)；放入乙巧超聲５分鐘，更換乙醇？再次超聲，重復(fù)逡逑３次（功率、頻率均調(diào)至最大

吸出每個(gè)溝道兩入口處的舊培養(yǎng)基，并在兩入口同時(shí)注入２０叫新鮮培養(yǎng)基，為逡逑片上ＶＳＭＣ提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)，直至培養(yǎng)７２小時(shí)，并在盈微鏡下拍照記錄逡逑ＶＳＭＣ數(shù)量、形態(tài)（圖３中子圖６）。注意同時(shí)加入相同液量培養(yǎng)基的目的是最逡逑大程度減少微溝道內(nèi)流體剪切力對ＶＳＭＣX椫場⒈硇偷撓跋�。辶x掀希鄭櫻停緬澹幔幔悖簦椋釹赴庖呷舊好看味際褂昧槳巖埔呵�，２０叫－１０叫液辶x狹坎罨灰骸Ｎ鼉膳嘌�，４％多緤J姿峁潭ǎ保搗種櫻揮茫校攏優(yōu)渲茫常サ乃跛義戲獗找�，封闭１v種櫻河們桑優(yōu)渲沒常サ模裕潁榛睿兀保埃巴改ひ和改ぃ保搗種櫻″義嫌茫校攏優(yōu)渲茫保埃ド窖蜓�，３�

本文編號：2561993