【摘要】：[目的]VSMC遷移是動脈粥樣硬化和血管術后內膜增生再狹窄病理進程的關鍵性階段。傳統(tǒng)體外細胞研究模型的局限性制約了VSMC生長微環(huán)境的表征,同樣降低了VSMC受調控作用的研究可信證據(jù)級別。本研究擬采用微流控技術在體外重建VSMC增殖、遷移微環(huán)境,并進一步引入高通量劃痕遷移表征不同類型VSMC在不同種類／不同濃度化學誘導物條件影響下的遷移現(xiàn)象。與既往文獻報道和傳統(tǒng)研究方法獲得的結論進行比較,解析細胞生長微環(huán)境變化對VSMC增殖、遷移的影響。有望在新細胞微環(huán)境平臺上,通過對VSMC相關功能和機制開展更為深入的研究,為再狹窄防治開拓新的思路和方案。[方法]1.基于微流控技術體外重建VSMC增殖微環(huán)境,通過重力作用實現(xiàn)微溝道內不同襯底基質修飾(玻璃表面、多聚賴氨酸、纖連蛋白、膠原蛋白)、VSMC注入、長期培養(yǎng)和平滑肌肌動蛋白α-actin免疫染色。2.基于微流控技術體外重建VSMC遷移微環(huán)境,通過重力作用實現(xiàn)微溝道內VSMC主入、培養(yǎng)、劃痕遷移,并定量分析不同芯片尺寸(微溝道高度100μm vs.250 μm,芯片厚度2mm vs.8mm)、不同襯底基質修飾(纖連蛋白vs.膠原蛋白)、不同細胞因子(無FBS,10%FBS,10%FBS+PDGF-BB, 10%FBS+TNF-a)、不同類型VSMC(人主動脈VSMC細胞系,人主動脈原代VSMC,鼠主動脈原代VSMC,正常內乳動脈原代VSMC,主動脈夾層病變部位原代VSMC)等條件下細胞遷移距離,比較實驗結果。3.基于微流控技術可控性好、精度高等優(yōu)點,通過電調控表面襯底,實現(xiàn)高通量實時研究細胞遷移,并定量分析不同類型VSMC (人主動脈VSMC細胞系,頸動脈粥樣硬化斑塊部位原代VSMC),在不同細胞因子濃度梯度(FBS, PDGF-BB, TNF-α, AngⅡ)下遷移距離,總結實驗結果,探索個中規(guī)律。4.對每次拍照后的VSMC在Image Pro Plus 6.0圖像處理軟件中人工測量,兩人背靠背,取平均值,用Microsoft 2007 excel軟件錄入并統(tǒng)計分析,實驗結果用均值±標準差表示,多組問均數(shù)比較采用ANOVA檢驗,檢驗水準為a=0.05(或0.01)代表組間差異有統(tǒng)計學意義(或高度統(tǒng)計學意義)。[結果]1.通過重力作用實現(xiàn)了微溝道內襯底基質修飾,VSMC注入、長期培養(yǎng)、觀察和細胞免疫染色。經(jīng)過參數(shù)優(yōu)化,實現(xiàn)了細胞在微溝道內的均勻分布(96.0±16.3/mm2)。與玻璃裸表面相比,細胞外基質(膠原蛋白、多聚賴氨酸、纖連蛋白)修飾的襯底在某個時間節(jié)點范圍內可以促進VSMC的增殖和表型改變。2.比較不同的芯片幾何尺寸、襯底表面修飾、細胞因子對VSMC遷移的影響,結果表明,1)微溝道高度對細胞遷移有顯著作用;2)與纖連蛋白相比,片上修飾膠原蛋白更能促進細胞遷移;3)FBS、PDGF-BB、TNF-α均能促進細胞遷移。另外,還量化了五種類型VSMC(人VSMC細胞系、人和鼠原代VSMC、兩例患者樣本分離培養(yǎng)得到的原代VSMC)的遷移能力,發(fā)現(xiàn)人細胞系和患者樣本的細胞遷移距離可比擬,但是顯著少于人和鼠原代細胞。3.基于高通量、可控性好的384孔劃痕遷移方法,結果表明,1)隨著FBS濃度升高,VSMC遷移距離增加,證實該大序列劃痕遷移技術的可行性；2)隨著PDGF-BB農(nóng)度升高,人VSMC細胞系遷移距離增加,但是沒有飽和的趨勢;3)隨著PDGF-BB農(nóng)度升高,產(chǎn)生遷移的動脈粥樣硬化斑塊部位原代VSMC個數(shù)上升,并在200ng/ml的位置出現(xiàn)峰值,之后又開始下降;4)隨著TNF-α濃度升高,產(chǎn)生遷移的動脈粥樣硬化斑塊部位原代VSMC個數(shù)無明顯變化;5)隨著AngⅡ濃度升高,產(chǎn)生遷移的動脈粥樣硬化斑塊部位原代VSMC個數(shù)有下降趨勢。[結論]1.基于微流控技術體外重建VSMC增殖微環(huán)境,該新型平臺技術開發(fā)了VSMC研究系列中新的VSMC培養(yǎng)模式。2.基于微流控技術體外重建VSMC遷移微環(huán)境,該新型平臺技術開發(fā)了VSMC研究系列中新的VSMC遷移模型。3.基于微流控技術實現(xiàn)VSMC大序列劃痕遷移,該新型平臺技術開發(fā)了一種高通量,自動化,適于實時觀察分析的研究模型。
【圖文】：

養(yǎng)微溝道陽模的方形塑料皿內：真空腔室抽氣３０分鐘Ｗ上，觀察表面，直至沒逡逑有氣泡為止；放入烘箱？調平，加熱ＰＤＭＳ使之固化（８０°邋Ｃ，至少１０小時），逡逑如圖２中子圖ＩＶ所示。逡逑ＰＤＭＳ模具剝離、清洗：將ＰＤＭＳ從方形皿中取出，然后將ＰＤＭＳ從玻片逡逑上剝離，并將玻片背面的巧巧撕下來尲在正面，防止溝道內落入灰塵：沿著玻片逡逑印跡切出長方形器件，，邊緣切割整齊，表面平整，使其小于玻片，邊緣突起也要逡逑切掉；使用直徑４ｍｍ打孔器對準器件上的圓形注入孔打孔（器件的溝道面朝上，逡逑下面墊上一層厚無塵紙），使完全洞穿，拔掉孔內ＰＤＭＳ；透明膠帶粘貼ＰＤＭＳ逡逑器件表面１０次，清除雜質；放入乙巧超聲５分鐘，更換乙醇？再次超聲，重復逡逑３次（功率、頻率均調至最大

吸出每個溝道兩入口處的舊培養(yǎng)基，并在兩入口同時注入２０叫新鮮培養(yǎng)基，為逡逑片上ＶＳＭＣ提供必需的營養(yǎng)物質，直至培養(yǎng)７２小時，并在盈微鏡下拍照記錄逡逑ＶＳＭＣ數(shù)量、形態(tài)（圖３中子圖６）。注意同時加入相同液量培養(yǎng)基的目的是最逡逑大程度減少微溝道內流體剪切力對ＶＳＭＣX椫場⒈硇偷撓跋�。辶x掀希鄭櫻停緬澹幔幔悖簦椋釹赴庖呷舊好看味際褂昧槳巖埔呵�，２０叫－１０叫液辶x狹坎罨灰�。吸滁兩培养基，４％多緤J姿峁潭ǎ保搗種櫻揮茫校攏優(yōu)渲茫常サ乃跛義戲獗找海獗眨保搗種櫻河們桑優(yōu)渲沒常サ模裕潁榛睿兀保埃巴改ひ和改ぃ保搗種櫻″義嫌茫校攏優(yōu)渲茫保埃ド窖蜓�，３�

本文編號：2561993