【摘要】：研究背景近年來,隨著人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變,以及人口老年化的發(fā)展,心血管疾病已成為威脅人類健康的首要?dú)⑹�。其�?心肌梗死(myocardial infarction,MI)是世界上致死率和致殘率最高的疾病之一。MI后,心肌細(xì)胞發(fā)生不可逆性死亡,引起MI區(qū)非收縮性瘢痕形成、膠原沉積和細(xì)胞外基質(zhì)降解,共同引起心臟形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的非適應(yīng)性改變,稱之為心室重構(gòu)。心室重構(gòu)會逐漸發(fā)展為心力衰竭(heart failure,HF),大大增加MI患者的再住院率和死亡率。近幾十年來,隨著心臟組織工程和再生醫(yī)學(xué)的迅速發(fā)展,心肌內(nèi)可注射性生物材料,比如水凝膠,展現(xiàn)出良好的心臟組織修復(fù)和促血管再生能力。姜黃素(curcumin,Cur)是一種是從姜科植物提取的多酚類化合物,具有抗炎、抗氧化和抗凋亡等藥理作用。研究證明,姜黃素可抑制壓力負(fù)荷或MI所致的心室重構(gòu),并可改善心功能。然而姜黃素的水溶性差和生物利用度低等缺點(diǎn)制約其臨床的應(yīng)用。一氧化氮(nitric oxide,NO)作為生物體內(nèi)一種重要的氣體信號分子,具有舒張血管、增加冠脈血流量、抑制血小板聚集和促進(jìn)血管再生等多重心血管保護(hù)作用。但是NO分子極其不穩(wěn)定,半衰期短,幾秒內(nèi)失活,嚴(yán)重制約其臨床應(yīng)用。目前,已經(jīng)研發(fā)出不少具有高效率地產(chǎn)生和釋放NO的生物材料,具有促進(jìn)皮膚傷口愈合、改善下肢缺血和促進(jìn)心肌梗死后血管再生等治療作用。近年來,不少研究表明在缺血性心臟病的治療方面,多種藥物聯(lián)合治療比單藥療效更顯著。因此,研究和制備可控制地釋放姜黃素和NO的小分子水凝膠,一方面提高姜黃素的水溶性和治療效果·,另一方面,水凝膠可提供力學(xué)支撐來改善MI后心功能;最后,姜黃素和NO聯(lián)合治療的效果可能具有協(xié)同效應(yīng)。研究目的制備并評價能在β-半乳糖苷酶(β-gal)催化下釋放一氧化氮的姜黃素—NO小分子水凝膠,并觀察心肌內(nèi)注射水凝膠對心肌梗死后小鼠的心功能、心室重構(gòu)、心肌細(xì)胞凋亡及血管新生的影響,并初步探討其作用機(jī)制。研究方法前期實(shí)驗(yàn)已分別合成帶有姜黃素的水凝膠前體化合物Ⅰ(Cur-FFE-ss-ERGD)和帶有NO供體的水凝膠前體化合物Ⅱ(Nap-FFGGG-NO)。現(xiàn)把兩者按一定的摩爾比例(化合物Ⅰ:化合物Ⅱ=4:1)混合后并溶于PBS溶液,加熱冷卻后再加入谷胱甘肽還原劑(GSH),可通過共組裝的方式形成黃色半透明的姜黃素-NO小分子水凝膠(Gel)。流變儀檢測Gel的力學(xué)性能,高分辨透射電鏡(TEM)檢測超微結(jié)構(gòu),液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)檢測姜黃素從Gel中的釋放,在給予200 U/L的半乳糖苷酶的情況下,用一氧化氮檢測試劑盒檢測N0的重Gel中的釋放。通過結(jié)扎雄性C57/BL6小鼠左前降支冠狀動脈構(gòu)建急性心肌梗死模型,并隨機(jī)將其分為3小組,saline組:MI周邊注射20 μL生理鹽水和尾靜脈注射50 μl生理鹽水;Gel組:MI周邊注射20 μL水凝膠和尾靜脈注射50μl生理鹽水;Gel+ β-gal組:MI周邊注射20 μ L水凝膠和尾靜脈注射50 μ 1濃度為0.4mg/ml的β-半乳糖苷酶溶液。此外,還設(shè)有假手術(shù)組(sham組),開胸和穿線,但不結(jié)扎冠狀動脈,不給予任何溶液或藥物治療。4周后,超聲心動圖檢測心功能,包括射血分?jǐn)?shù)(EF)、縮短分?jǐn)?shù)(FS)、左室舒張末內(nèi)徑(LVIDd)和左室收縮末內(nèi)徑(LVIDs),其中心電圖(ECG)結(jié)果也被記錄下來;然后處死小鼠,迅速取出心臟標(biāo)本并固定,切成薄片。Masson染色觀察心臟結(jié)構(gòu)和心肌纖維化程度;組織Tunel染色觀察心肌細(xì)胞凋亡程度;vWF免疫熒光觀察新生血管密度,免疫組織化學(xué)染色觀察心臟組織SIRT1、TGFβ 1和MMP-2表達(dá)情況,并每組取出3只新鮮小鼠的心臟組織,研碎后行Western Blot定量分析SIRT1、TGFβ 1和MMP-2蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.水凝膠的性能:水凝膠外觀呈黃色果凍狀,含有濃度為0.5wt%的化合物I和0.17wt%的化合物II。它可在室溫下穩(wěn)定保存至少一個月。TEM提示水凝膠為三維(3D)網(wǎng)狀的微觀形貌,由直徑大約為20-80 nm的納米纖維纏繞交織成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)并包裹大量水分子而形成水凝膠。流變儀的頻率掃描(frequency sweep)和張力掃描(strain sweep)均提示彈性模量(G')與粘性模量(G'')的比值是一個數(shù)量級以上,說明水凝膠的真正形成,具有較強(qiáng)的彈性和抗壓性;水凝膠可通過酯鍵的水解釋放出姜黃素單體,在常溫下前24小時的累積釋放量大約為2.43 μg/mL,占總量的0.84%,說明水凝膠具有持續(xù)緩慢釋放能力。水凝膠在PBS溶液只緩慢釋放姜黃素,給予200 U/L的β-半乳糖苷酶后,可檢測到N0釋放,前48小時的最大累計(jì)釋放量占總量的26.14%,且保持低濃度緩慢釋放狀態(tài),而不加酶的情況,始終檢測不到N0的釋放,說明水凝膠可控性釋放N0。2.超聲心動圖結(jié)果:心梗模型各組心電圖顯示明顯的病理性Q波形成,而非心梗組呈正常的qRs波,表明心肌梗死模型的成功建立(已形成陳舊性心肌梗死)。與sham組相比,saline組、Gel組和Gel+-gal組的心功能指標(biāo)FS、EF顯著降低(P0.01),而LVIDd、LVIDs明顯升高(P0.05);與saline組比較,Gel組和Gel+β-gal的FS、EF均升高,LVIDd、LVIDs降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與Gel組比較,Gel + β-gal組FS、EF明顯升高,LVIDd、LVIDs 明顯降低(P0.05)。3.Masson染色結(jié)果:sham組心臟左室腔大小及幾何形態(tài)正常,有極少量纖維化,而saline組左室腔明顯離心性擴(kuò)大,心室壁明顯變薄,纖維化面積明顯增加(P0.01);與saline組相比,Gel組和Gel+ β-gal組室壁厚度有所增加,左室腔變小,纖維化面積減少(P0.01);其中,與Gel組比較,Gel+β-gal組心臟形態(tài)更接近正常,纖維化程度更輕(P0.05)。4.心肌細(xì)胞凋亡結(jié)果:通過Tunel染色提示,sham組心肌細(xì)胞排列非常規(guī)整,凋亡陽性心肌細(xì)胞的百分比率非常低,而在saline組心肌細(xì)胞排列十分紊亂,凋亡率異常升高,兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。Gel組經(jīng)姜黃素治療后凋亡率明顯降低,與saline組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。在Gel+ β-gal組,細(xì)胞排列接近正常,凋亡率明顯低于Gel組(P0.05)。5.心梗區(qū)血管新生情況:與sham組比較,saline組和Gel組血管新生增加,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而在Gel+β-gal中,新生血管密度明顯增加約是其他組兩倍,與其他三組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6.心肌組織蛋白表達(dá)情況:通過組織免疫化學(xué)染色和心臟組織Western Blot檢測提示,與sham組比較,saline組的SIRT1表達(dá)降低(P0.05),而TGFβ1和MMP-2表達(dá)增加(P0.05);與saline組相比,Gel組和Gel+β-gal組均可增加SIRT1表達(dá)(P0.05),降低TGFβ 1和MMP-2表達(dá)(P0.05)。與Gel組相比,Gel +β-gal組更明顯增加SIRT1表達(dá),降低TGFβ 1和MMP-2表達(dá)(P0.05)。結(jié)論1.成功制備姜黃素-NO小分子水凝膠,具有良好力學(xué)性能,自身可緩慢釋放出姜黃素,而只有額外添加β-半乳糖苷酶才可釋放NO,具有可控性和緩釋效果。2.姜黃素-NO小分子水凝膠可明顯改善小鼠心肌梗死后心功能,減輕心肌纖維化,減輕細(xì)胞凋亡和促進(jìn)血管新生。當(dāng)水凝膠同時釋放姜黃素和NO時,其治療效果比單獨(dú)釋放姜黃素的更好,說明姜黃素與NO在小鼠心肌梗死治療上具有協(xié)同效應(yīng)。3.姜黃素和NO的協(xié)同的心臟保護(hù)效應(yīng)的潛在分子機(jī)制可能與提高SIRT1表達(dá),降低TGFβ1和MMP-2的表達(dá)有關(guān)。
【圖文】：

圖１邋Ａ）化合物Ｉ及化合物ＩＩ的結(jié)構(gòu)式，Ｂ）邋（Ｉ）為化合物Ｉ的溶液，（ＩＩ）逡逑為化合物ＩＩ的混懸液，（ＩＩＩ）為姜黃素－ＮＯ小分子水凝膠，Ｄ）水凝膠的ＴＥＭ微逡逑觀結(jié)構(gòu)（Ｂａｒ＝０．邋５邋ｕ邋ｍ）。逡逑Ｆｉｇ邋１邋Ａ）邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ邋ｆｏｒｍｕｌａ邋ｏｆ邋ｃｏｍｐｏｕｎｄ邋Ｉ邋ａｎｄ邋ｃｏｍｐｏｕｎｄ邋ＩＩ，，邋Ｂ）邋ｏｐｔｉｃａｌ逡逑ｉｍａｇｅｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｓｏｌｕｔｉｏｎ邋（Ｉ），ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ邋（ＩＩ）邋ａｎｄ邋ｈｙｄｒｏｇｅｌ邋（ＩＩＩ），邋Ｄ）ＴＥＭｏｆ逡逑ｈｙｄｒｏｇｅｌ邋（Ｂａｒ＝０．邋５邋ｗｍ）．逡逑３．１姜黃素－ＮＯ小分子水凝膠的配制及特點(diǎn)逡逑如圖１邋Ａ）及Ｂ）所示，根據(jù)前期的實(shí)驗(yàn)研究，化合物Ｉ結(jié)構(gòu)為Ｃｕｒ－ＦＦＥ－ｓｓ－ＥＲＧＤ，逡逑姜黃素通過酯鍵連接到多肽ＦＦＥ－ｓｓ－ＥＲＧＤ上，此多肽通過二硫鍵（－ｓｓ－）把親水逡逑端ＥＲＧＤ多肽序列和疏水端Ｃｕｒ－ＦＦＥ序列連接起來。其中Ｆ為苯丙氨酸，具有苯逡逑環(huán)結(jié)構(gòu)，通過苯環(huán)的折疊的物理作用，具有促進(jìn)成膠的能力。圖Ｂ中的Ｉ逡逑所示，化合物Ｉ在ＰＢＳ溶液中水溶性很好，成黃色透明的溶液狀態(tài)，水溶性可達(dá)逡逑１０ｍｇ／ｍｌ（１０ｗｔ％）。通過加入４當(dāng)量的還原性谷胱甘肽把二硫鍵斷開，化合物Ｉ逡逑在ＰＢＳ中的水溶性突然降低，就會自組裝成單獨(dú)的姜黃素水凝膠［５５］（圖中未給出逡逑單獨(dú)的姜黃素水凝膠的圖片）。該單純的姜黃素水凝的最低成膠濃度為０．５邋ｗｔ％逡逑（０．邋５ｍｇ／ｍｌ）。化合物ＩＩ結(jié)構(gòu)為Ｎａｐ－ＦＦＧＧＧ－ＮＯ，由帶有半乳糖基團(tuán)保護(hù)的親核逡逑

Ａ）和在１邋ｒａｄ／ｓ的頻率下的張力掃描Ｂ），其中方形的點(diǎn)代表彈性模量（Ｇ’）和逡逑圓點(diǎn)代表粘性模量（Ｇ’邋’）；邋Ｃ）代表姜黃素從水凝膠釋放到（３７°邋Ｃ，ｐＨ＝７．４）逡逑的ＰＢＳ溶液中的累積釋放量；Ｄ）４８小時內(nèi)，在給予濃度為０．邋２邋Ｕ／ｍｌ的半乳糖甘逡逑酶催化下的ＮＯ累積釋放量與總量的比例。逡逑Ｆｉｇ２邋Ａ）邋ａｎｄ邋Ｂ）邋Ｄｙｎａｍｉｃ邋ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ邋ｓｗｅｅｐ邋ａｔ邋ｔｈｅ邋ｓｔｒａｉｎ邋ｏｆ邋１％邋ａｎｄ邋ｓｔｒａｉｎ逡逑ａｔ邋ｔｈｅ邋ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ邋ｏｆ邋１邋ｒａｄ／ｓ邋ｏｆ邋ｈｙｄｒｏｇｅｌ邋ｆｏｒｍｅｄ邋ａｆｔｅｒ邋２邋ｈｏｕｒｓ邋ａｔ邋３７邋０邋Ｃ逡逑（ｔｈｅ邋ｓｑｕａｒｅ邋ｓｙｍｂｏｌｓ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｅｌａｓｔｉｃｉｔｙ邋（Ｇ＊邋）邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｓｐｈｅｒｅ邋ｏｎｅｓ逡逑ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ邋（Ｇ’邋Ｊ邋），邋Ｃ）邋Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ邋ｒｅｌｅａｓｅ邋ａｍｏｕｎｔ邋ｏｆ邋ｃｕｒｃｕｍｉｎ逡逑ａｔ邋３７°邋Ｃ邋ｉｎ邋ＰＢＳ邋ｂｕｆｆｅｒｓ邋（ｐＨ邋＝邋７．邋４）邋ｆｒｏｍ邋ｈｙｄｒｏｇｅｌ邋ｆｏｒ邋２４邋ｈｏｕｒｓ，邋Ｄ）邋Ｔｈｅ逡逑ｒｅｌｅａｓｅ邋ｐｒｏｆｉｌｅ邋ｏｆ邋ＮＯ邋ｆｒｏｍ邋ｈｙｄｒｏｇｅｌ邋ｗｉｔｈ邋ｏｒ邋ｗｉｔｈｏｕｔ邋０．２邋Ｕ／ｍｌ逡逑０－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ邋ｆｏｒ邋ｏｖｅｒ邋４８邋ｈｏｕｒｓ．逡逑３．邋４藥物從小分子水凝膠中釋放的結(jié)果逡逑３．４．１姜黃素的釋放結(jié)果逡逑根據(jù)己知姜黃素單體濃度及ＬＣ－ＭＳ對應(yīng)的峰面積，用ＯｒｉｇｉｎＰｒｏ邋９．邋０做出標(biāo)逡逑準(zhǔn)曲線為Ｙ＝ｌ．邋２４ｘｌ０８Ｘ＋３６７４２８．邋４２．在圖２邋Ｃ中看出，因姜黃素是通過
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R542.22


本文編號：2560677