【摘要】：背景：流行病學(xué)分析顯示當(dāng)今社會(huì)導(dǎo)致死亡的主要疾病主要為高血壓,冠心病等心血管疾病,但隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)與研究手段的發(fā)展,這方面的救治成功率得到了明顯提高。雖然心血管病的致死率逐年降低,但它們最終的轉(zhuǎn)歸即慢性心力衰竭卻呈現(xiàn)日益增加,因此救治慢性心力衰竭成為防治的重點(diǎn)。慢性心衰出現(xiàn)后心肌功能多受損,原因各有不同。慢心衰前期多會(huì)出現(xiàn)心肌肥厚,心肌肥厚又是導(dǎo)致慢性心衰的重要原因之一,二者互為因果。近年來在多種生命體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種新的小分子RNA, microRNAs,具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后的活性,更進(jìn)一步又發(fā)現(xiàn)很多microRNAs與心肌肥厚密切相關(guān)。nicroRNAs若要發(fā)揮生物學(xué)的功能,它的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物必須經(jīng)過多次酶剪切加工后形成成熟的microRNAs。過程如下最初的microRNAs經(jīng)過RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄后,首先形成初始microRNAs(Pri-microRNAs),再經(jīng)Drosha剪切,變成前體microRNAs (Pre-microRNAs),有其特有的發(fā)卡結(jié)構(gòu)；Pre-microRNAs從胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至胞漿,此過程由Exportin-5參與,在胞漿中被Dicer酶剪切,形成雙鏈microRNAs分子；最后,雙鏈microRNAs分離,只有一條成為成熟的microRNAs,再與別的分子一起形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC), RISC再通過與mRNA的3’端非編碼區(qū)相互作用,引起靶基因mRNA的降解或者翻譯抑制,就是前面所講在轉(zhuǎn)錄后負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)。microRNAs通過轉(zhuǎn)錄后負(fù)性調(diào)節(jié)目的蛋白質(zhì)參與許多心血管疾病。我們通過升主動(dòng)脈縮窄(transverse aorta constriction,TAC)對(duì)小鼠進(jìn)行短期與長(zhǎng)期的壓力負(fù)荷,建立了心肌肥厚與心力衰竭的模型,同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行miR-455的上調(diào),旨在探討miR-455在壓力負(fù)荷心肌肥厚中的細(xì)胞與分子學(xué)機(jī)制,為預(yù)防與治療心肌肥厚提供新的思路。第一部分miR-455通過調(diào)控鈣網(wǎng)蛋白促進(jìn)短期壓力負(fù)荷心肌肥厚的心肌細(xì)胞肥大目的：最近研究顯示,：microRNAs與多種心血管疾病有關(guān),但是迄今為止并沒有miRNA-455(miR-455)與心肌肥厚的研究。我們通過小鼠升主動(dòng)脈縮窄(transverse aorta constriction,TAC)2周建立了心肌肥厚的模型,旨在探討miR-455在心肌肥厚中細(xì)胞與分子學(xué)機(jī)制。方法：選用18只昆明種小鼠,隨機(jī)分為手術(shù)結(jié)扎(升主動(dòng)脈縮窄)+miR-455為實(shí)驗(yàn)組(TAC. miR-455,尾靜脈注射包被miR-455的腺病毒),手術(shù)結(jié)扎+GFP為陰性對(duì)照組(TAC. GFP,尾靜脈注射包被綠色熒光蛋白的腺病毒)和假手術(shù)組(Sham,尾靜脈注射包被綠色熒光蛋白的腺病毒)。術(shù)后2周測(cè)量小鼠血流動(dòng)力學(xué)及心臟超聲數(shù)據(jù)；對(duì)心肌組織進(jìn)行HE和Masson染色觀察組織病理學(xué)變化；應(yīng)用qRT-PCR方法檢測(cè)肥大基因與纖維化基因的表達(dá)；Western blot分析凋亡蛋白；qRT-PCR與Western blot分析miR-455的靶基因和蛋白。結(jié)果：1 miR-455在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)染在尾靜脈注射GFP的TAC后2周的小鼠體內(nèi)miR-455有明顯的降低,而經(jīng)過尾靜脈注射miR-455前體的TAC后2周的小鼠體內(nèi)miR-455有明顯的升高,TAC.GFP組與Sham組相比較,TAC.miR-455組與TAC.GFP組相比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.01)。2 miR-455對(duì)TAC后2周小鼠血流動(dòng)力學(xué)及心臟超聲和組織病理學(xué)的影響2周時(shí),經(jīng)右側(cè)頸動(dòng)脈測(cè)壓顯示,同Sham組比較,TAC小鼠BP和LVESP明顯升高,其差值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但是同Sham組比較,TAC2周時(shí)LVEDP無明顯變化。2周時(shí),TAC.GFP組與Sham組比較,心肌細(xì)胞橫截面積增大,心重體重比增加,LVAWd明顯增加,LVIDd變小,EF增加,其差值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。這些指標(biāo)在TAC.miR-455組有了進(jìn)一步的發(fā)展(P0.05),如心肌細(xì)胞橫截面積進(jìn)一步增大,心重體重比,LVAWdEF增加,LVIDd變小,但EF值2組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3 miR-455對(duì)心肌肥厚基因的影響我們?cè)u(píng)估了基因轉(zhuǎn)染后心肌肥厚基因Anf, Actal和Myh7的表達(dá)。2周時(shí)和Sham組相比較,TAC.GFP組小鼠心肌組織中Anf, Actal和Myh7有明顯增加(P0.01),而且在TAC.miR-455組,Anf, Actal和Myh7的表達(dá)有進(jìn)一步增加(P0.01)。4 miR-455對(duì)心肌纖維化的影響2周時(shí)通過Masson染色,Sham組可見少量膠原纖維散在分布于心肌細(xì)胞間隙中,呈現(xiàn)藍(lán)色,心肌細(xì)胞呈紅色,我們觀察到TAC.GFP組和TAC.miR-455組較之于Sham組心肌膠原纖維明顯增加,但2者相比差異不明顯。對(duì)于代表心肌纖維化的基因Tgfβ1和Ctgf,較之于Sham組,在TAC.GFP組和TAC.miR-455組的表達(dá)都有明顯上升(P0.05),但2者比較無明顯差異(P0.05)。5 miR-455對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響Western blot示2周時(shí)TAC.GFP組促凋亡蛋白Bax有明顯上升,TAC.miR-455組變化不明顯(P0.05)o TAC.GFP組和TAC.miR-455組抗凋亡蛋白Bcl-2有所下降,但兩者比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6在TAC導(dǎo)致的心肌肥厚中鈣網(wǎng)蛋白是miR-455的target gene我們進(jìn)行了Calr和GRP78基因與蛋白的檢測(cè),Western blot分析,TAC.GFP組Calr和GRP78升高,但經(jīng)過了miR-455的干擾,GRP78依然升高,而Calr卻有了明顯下降,說明Calr是miR-455的target gene之一。PCR不Calr下降同時(shí)也有Calr mRNA的下降,說明miR-455對(duì)Calr的調(diào)節(jié)是通過降低mRNA來抑制蛋白翻譯。小結(jié)：短期壓力負(fù)荷后小鼠出現(xiàn)了代償性心肌肥厚的特征,表現(xiàn)為心室壁的增厚,心室腔的縮小以及心臟收縮功能的增強(qiáng),出現(xiàn)明顯心肌細(xì)胞增大,病理學(xué)出現(xiàn)明顯心肌細(xì)胞增大。伴隨出現(xiàn)胎兒基因的重新激活。miR-455通過降解靶mRNA,Calr降低這條途徑,使得心肌細(xì)胞進(jìn)一步增大,心肌肥厚更加明顯。第二部分miR-455通過調(diào)控鈣網(wǎng)蛋白減輕長(zhǎng)期壓力負(fù)荷心肌肥厚小鼠的心肌纖維化和心肌凋亡目的：心肌肥厚出現(xiàn)后,左心室重構(gòu)進(jìn)行性進(jìn)展,會(huì)導(dǎo)致猝死、心力衰竭、心律失常等嚴(yán)重心臟事件。左室重構(gòu)主要表現(xiàn)為：心肌細(xì)胞肥大、心肌凋亡增加、非心肌細(xì)胞(成肌纖維細(xì)胞),非細(xì)胞成分(膠原纖維)增加和心肌電生理以及代謝異常。我們構(gòu)建了TAC后4周心力衰竭的小鼠,同時(shí)用miR-455進(jìn)行干擾,以期了解miR-455對(duì)心肌纖維化和細(xì)胞凋亡的分子生物學(xué)影響及機(jī)制。方法：本研究建立了TAC 4周后的小鼠模型,并對(duì)miR-455進(jìn)行干擾,測(cè)量小鼠血流動(dòng)力學(xué)及心臟超聲數(shù)據(jù),對(duì)心肌組織進(jìn)行HE和Masson染色觀察組織病理學(xué)變化；應(yīng)用PCR方法檢測(cè)肥大基因與纖維化基因；TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡,Western blot分析凋亡蛋白；PCR與Western blot分析miR-455的target gene與蛋白表達(dá)。結(jié)果：1 miR-455在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)染在尾靜脈注射GFP的TAC后4周的小鼠體內(nèi)miR-455有明顯的降低,而經(jīng)過尾靜脈注射miR-455前體的TAC后4周的小鼠體內(nèi)miR-455有明顯的升高,TAC.GFP組與Sham組相比較,TAC.miR-455組與TAC.GFP組相比較,均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.01)。2 miR-455對(duì)TAC后4周小鼠血流動(dòng)力學(xué)及心臟超聲的影響在TAC后的4周,與TAC后2周比較,雖然BP, LVESP,心重體重比及心肌細(xì)胞橫截面積無明顯變化,但觀察到LVEDP增高,LVAWd變薄,LVIDd變大,EF下降(P0.05),說明這些小鼠發(fā)生了明顯的心肌重塑。但在TAC.miR-455組雖然LVAWd有所變薄(P0.05),但LVIDd并未見到明顯的擴(kuò)大(P0.05),EF也無明顯下降,也就是說,經(jīng)過miR-455干擾的小鼠心肌依然保持著心肌肥厚的狀態(tài)。這些結(jié)果暗示出miR-455可以阻止TAC4周后的心肌重塑。3 miR-455對(duì)心肌肥厚基因的影響4周時(shí),和Sham組相比較,TAC.GFP組和TAC.miR-455組小鼠心肌組織中Anf, Actal和Myh7有進(jìn)行性上升(P0.05),但有一個(gè)現(xiàn)象值得注意,Myh7的表達(dá)在TAC.GFP組超過了TAC.miR-455組(P0.01)。4 miR-455對(duì)心肌纖維化的影響心肌組織切片Masson染色顯示:Sham組可見少量膠原纖維散在分布于心肌細(xì)胞間隙中,呈現(xiàn)藍(lán)色,心肌細(xì)胞呈紅色;TAC.GFP組較之于Sham組心肌膠原纖維明顯增加,而TAC.miR-455組較之于TAC.GFP組心肌膠原纖維卻有顯著地減少。對(duì)于代表心肌纖維化的基因Tgfβ1和Ctgf,雖然較之于Sham組,在TAC.GFP組和TAC.miR-455組的表達(dá)都有明顯上升,但在4周時(shí),Tgfβ1和Ctgf在TAC.miR-455組的表達(dá)要低于在TAC.GFP組的表達(dá)(P0.01)。說明miR-455可以減輕TAC4周后的心肌重塑。5 miR-455抑制心肌細(xì)胞凋亡經(jīng)過TUNEL染色,TAC.GFP組凋亡細(xì)胞明顯增多,而TAC.miR-455組凋亡細(xì)胞較之于TAC.GFP組有明顯下降。通過Western blot分析,我們檢測(cè)了抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax,結(jié)果顯示,TAC.miR-455組較之于TAC.GFP組抗凋亡蛋白Bcl-2有顯著上升,促凋亡蛋白Bax有明顯下降。6在TAC導(dǎo)致的心肌肥厚中鈣網(wǎng)蛋白是miR-455的target gene我們進(jìn)行了Calr和GRP78基因與蛋白的檢測(cè),Western blot分析,TAC.GFP組Calr和GRP78升高,但經(jīng)過了miR-455的干擾,GRP78依然升高,而Calr卻有了明顯下降,說明Calr是miR-455的target gene之一。PCR示Calr下降同時(shí)也有Calr mRNA的下降,說明miR-455對(duì)Calr的調(diào)節(jié)是通過降低mRNA來抑制蛋白翻譯。小結(jié)：長(zhǎng)期壓力負(fù)荷后小鼠出現(xiàn)了失代償心衰的特征,表現(xiàn)為左室舒張末期壓力的明顯增高,因?yàn)樾氖仪怀霈F(xiàn)擴(kuò)大影響了心臟收縮功能,左室射血分?jǐn)?shù)降低,出現(xiàn)明顯心肌纖維化和心肌細(xì)胞凋亡,同時(shí)伴隨纖維化基因與凋亡蛋白的改變。若長(zhǎng)期上調(diào)miR-455,會(huì)降解靶mRNA,使Calr降低,會(huì)減輕心肌纖維化及凋亡,減緩了心力衰竭的進(jìn)程。結(jié)論：在本研究中我們得到以下結(jié)論：短期壓力負(fù)荷后小鼠出現(xiàn)了代償性心肌肥厚的特征,表現(xiàn)為心室壁的增厚,心室腔的縮小以及心臟收縮功能的增強(qiáng),病理學(xué)出現(xiàn)明顯心肌細(xì)胞增大。伴隨出現(xiàn)胎兒基因的重新激活。miR-455通過降解靶mRNA, Calr降低這條途徑,使得心肌細(xì)胞進(jìn)一步增大,心肌肥厚更加明顯。我們可以通過對(duì)miR-455進(jìn)行調(diào)節(jié)來減輕心肌肥厚。長(zhǎng)期壓力負(fù)荷后小鼠出現(xiàn)了失代償心衰的特征,表現(xiàn)為左室舒張末期壓力的明顯增高,心室腔擴(kuò)大以及心臟收縮功能的降低,出現(xiàn)明顯心肌纖維化和心肌細(xì)胞凋亡,同時(shí)伴隨纖維化基因與凋亡蛋白的改變。上調(diào)miR-455降解靶mRNA,Calr降低,會(huì)減輕心肌纖維化及凋亡。因此在不同的時(shí)間段對(duì)miR-455進(jìn)行不同的調(diào)控,可以減輕壓力負(fù)荷導(dǎo)致心肌肥厚及延緩心力衰竭的進(jìn)程。
【圖文】：

３也肌肥厚的信號(hào)傳導(dǎo)逡逑ＰＢＫ／Ａｋｔ、環(huán)鳥巧酸／蛋白激酶Ｇ－１、ＭＡＰＫ等信號(hào)通路是也肌肥厚逡逑的發(fā)病機(jī)制中涉及到較為經(jīng)典的傳導(dǎo)通路。如圖１。逡逑３．１腫瘤壞死因子－ａ邋（ＴＮＦ－ａ）逡逑也肌肥厚的發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，研究顯示正－１、化－６、ＴＮＦ－ａ等因子逡逑都參與了這一炎性綜合租ｉｗｉｊ；當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)也肌衰弱時(shí)，根據(jù)不同的炎性、逡逑生物學(xué)反應(yīng)激可發(fā)現(xiàn)來自淋己細(xì)胞、中性粒及巨隆細(xì)胞的ＴＮＦ－ａ的水平會(huì)逡逑發(fā)生相應(yīng)的改變。如氧化應(yīng)激、壓力超負(fù)荷等刺激都會(huì)使ＮＦｋＢ活化，激逡逑活后的ＮＦｋＢ可轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，結(jié)合于ＤＮＡ中存在的ＴＮＦ－ａ啟動(dòng)子，接逡逑著進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，翻譯出ｐｒｏ－ＴＮＦ－ａ，然后聯(lián)合ＴＮＦ－ａ轉(zhuǎn)化酶（ＴＡＣＥ）產(chǎn)生逡逑較為穩(wěn)定的ＴＮＦ－ａ，最終引發(fā)也肌功能障礙。某些ＴＮＦ－ａ可向胞外釋放，逡逑結(jié)合ＴＮＦＲ受體后，參與機(jī)體的炎癥過程，激活后對(duì)也肌功能造成損傷Ｐｑ。逡逑但若ＴＮＦ－ａ水平較低則會(huì)引起一定程度的也肌保護(hù)效應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R541.6

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本文編號(hào)：2559407