【摘要】：深靜脈血栓形成(Deep venous thrombosis,DVT)發(fā)病率高,危害大,難以早期預測診斷。DVT發(fā)病機制復雜,涉及血管內(nèi)皮細胞、白細胞、血小板及凝血因子和纖溶系統(tǒng)等諸多角色及系統(tǒng)。靜脈內(nèi)皮細胞結構和功能的紊亂是DVT形成的始動因素,其通過調(diào)節(jié)血管的收縮與舒張,血小板與白細胞的粘附、活化、聚集,打破凝血/抗凝、纖溶/抗纖的動態(tài)平衡,影響DVT的發(fā)生發(fā)展。近年來研究表明,氧化應激引起靜脈內(nèi)皮細胞損傷是DVT形成的重要因素之一,活性氧自由基可導致內(nèi)皮細胞氧化損傷、老化、凋亡,啟動促凝血反應引發(fā)血栓形成。同時,在動脈血栓中的研究發(fā)現(xiàn),沉默信息調(diào)節(jié)因子1 (Silent information regulator 1, SIRT1)可通過抑制TNF-α介導的炎性反應改善內(nèi)皮細胞功能,修復內(nèi)皮細胞損傷,減少動脈血栓形成。本課題組前期在DVT動物模型及靜脈內(nèi)皮細胞損傷模型等體內(nèi)和體外實驗中,采用RT-PCR、Western blot、基因芯片、生物信息學分析等技術發(fā)現(xiàn)并驗證了KLF15、Rac1、MCP-1、IL-18和NF-κB等調(diào)控氧化應激的核心基因、蛋白的表達變化可促進內(nèi)皮細胞損傷,導致DVT形成。然而,上述關鍵基因在氧化應激反應中的上下游調(diào)控關系仍不明朗；氧化應激誘導靜脈內(nèi)皮細胞損傷凋亡、釋放促血栓分子、促進DVT形成的具體信號轉導機制也不完全清楚；SIRT1是否能修復靜脈內(nèi)皮細胞損傷,進而抑制DVT形成的作用和機制目前尚未報到。為此,本課題旨在探討：①氧化應激損傷(Oxidative Stress Injury, OSI)誘導靜脈內(nèi)皮細胞損傷、凋亡的信號轉導通路：②沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)在OSI誘導內(nèi)皮細胞損傷凋亡中的保護作用及調(diào)控機制；③SIRT1抑制內(nèi)皮細胞分泌促血栓分子、影響DVT形成的作用及分子機理。動物實驗中,對SIRT1和氧化應激損傷分子標志物一活性氧(Reactive oxygen species, ROS)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)在小鼠DVT模型中的表達變化作一初步研究。細胞實驗中,建立過氧化氫誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞氧化損傷模型,通過過表達和抑制SIRT1,探討SIRT1及下游PI3-K/Akt/GSK3β、MAPKs(c-Jun、ERK1/2、p38)、NF-κB、Nfr2/ARE等關鍵基因、信號通路調(diào)控HUVECs凋亡、分泌促血栓相關分子,進而影響DVT形成的作用及分子機制。為找到防治DVT形成的關鍵靶點提供新的理論依據(jù)。[目的]1.研究氧化應激反應誘導靜脈內(nèi)皮細胞損傷、凋亡的具體信號轉導通路;2.探討SIRT1對氧化應激誘導靜脈內(nèi)皮細胞損傷的修復作用及調(diào)控機制；3.探索SIRT1調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞分泌促血栓分子、抑制DVT形成的分子機理。[方法]1.體內(nèi)實驗：90只C57小鼠隨機分為空白組30只(Control,n=30)、假手術組30只(Sham, n=30)、DVT組30只(DVT, n=30)。DVT組采用下腔靜脈狹窄法造模,造模后24小時獲取小鼠下腔靜脈組織。HE染色觀察血栓形成情況；試劑盒檢測SOD、MDA含量；Western blot法檢測SIRT1蛋白的表達變化；DCFH-DA熒光探針捕獲、流式細胞儀檢測靜脈壁組織中ROS含量。2.體外實驗：①以0、100、200、400μmol/L濃度的H2O2分別處理人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)4、12、24小時,MTT法檢測細胞活力,以明確H2O2最適損傷濃度及時間。②以10、20、30μmol/L濃度的SIRT1激動劑預處理HUVECs 2h后,將其暴露在200μmok/L的H2O2中24h, MTT法檢測細胞活力,以明確SIRT1對HUVECs氧化損傷的保護作用及其最適濃度。③以30pmol/L濃度的SIRT1激動劑預處理HUVECs 2h后,將其暴露在200pmol/L的H202中24h,DCFH-DA熒光探針捕獲、激光共聚焦顯微鏡觀察,雙氫羅丹明123(DHR123)染色、流式細胞儀技術檢測細胞內(nèi)ROS含量,以明確SIRT1的抗氧化作用。原位末端標記(TUNEL)法、AnnexinV/PI雙染法、流式細胞儀檢測細胞凋亡率；Western blot檢測Bcl-2、Caspase-3凋亡相關蛋白的表達變化,以明確SIRT1抑制氧化應激誘導HUVECs凋亡的作用。④將HUVECs暴露在200μmol/L的H202中,在0、15min、30min、1h、2h、 3h、4h、8h時Western blot檢測PI3-K/Akt、MAPKs通路關鍵蛋白的表達變化,以明確氧化應激反應中關鍵信號通路蛋白隨時間的變化情況。⑤以30μmol/L的SIRT1激動劑預處理HUVECs2h后,將其暴露在200μmol/L的H2O2中,4h后Real-time PCR、Western blot檢測SIRT1、 PI3-K/Akt/GSK3p、 MAPKs、NF-κB、Nfr2/ARE信號通路關鍵基因、蛋白的表達變化,以探討氧化應激介導內(nèi)皮細胞損傷凋亡的信號轉導通路及SIRT1的調(diào)控作用。3.體外實驗：①免疫熒光標記,熒光顯微鏡觀察SIRT1蛋白在]HUVECs細胞中的定位情況。②以10、20、30μmol/L濃度的SIRT1激動劑預處理HUVECs2h后,將其暴露在200μmol/L的H2O2中,24h后Western blot檢測P-Selectin. PSGL-1、vWF、TM蛋白的表達變化,以探討SIRT1對內(nèi)皮細胞分泌促血栓形成分子的調(diào)控作用及其濃度依賴效應。③以30pmol/L的SIRT1激動劑預處理HUVECs 2h,加或不加SIRT1特異性抑制劑EX527,將其暴露在200pmol/L的H202中,24h后Real-time PCR、Western blot檢測P-Selectin. PSGL-1、vWF、TM基因和蛋白的表達變化,以驗證SIRT1調(diào)控內(nèi)皮細胞分泌促血栓形成分子,影響DVT形成的作用及機制。[結果]1.DVT組死亡率0%、成栓率83.3%、狹窄率96.05%±0.62%、殘余管腔橫截面積百分比3.95%±0.62%、血栓長度5.57±0.32mm、血栓濕重0.013±0.009g、下腔靜脈直徑1.52±0.03mm。SIRT1、SOD、MDA和ROS的表達在正常組與假手術組相比較均無統(tǒng)計學差異(P0.05)。DVT組靜脈壁組織超氧化物歧化酶(SOD)的含量顯著低于正常組和假手術組,丙二醛(MDA)的含量顯著高于正常組和假手術組(P0.05)。DVT組SIRT1蛋白的表達低于正常組和假手術組(P0.05)。DVT組靜脈壁組織中活性氧(ROS)含量顯著高于正常組和假手術組(P0.05)。2.①以0、100、200、400μmol/L濃度的H2O2分別處理人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)4、12、24小時,細胞活力顯示出顯著的的濃度與時間依賴性,隨H202濃度的增加和干預時間的延長,細胞活力逐漸下降(P0.01),200μmol/L組和400μmol/L組各時間點OD值相比無統(tǒng)計學差異(P0.05),說明細胞活力下降至平臺期,不隨H202濃度的增加而下降。參考前期研究和經(jīng)典文獻結果,選取200μmol/L、24h為H202最適干預濃度和時間。②以10、20、30μ mol/L濃度的SIRT1激動劑預處理HUVECs 2h后,細胞活力逐漸恢復(P0.05),并顯示出一定的濃度依賴性,隨SIRT1激動劑濃度的增加,細胞活力逐漸恢復(P0.05),因30μmol/L的SIRT1激動劑作用效果最顯著,故選取30μmol/L為后續(xù)實驗濃度。③以200μmol/L H2O2處理HUVECs 24h,細胞凋亡率、凋亡相關蛋白的表達(Bcl-2、Casepase-3)、胞內(nèi)ROS含量顯著增加(P0.05),而予30μmol/L的SIRT1激動劑預處理2h后,上述指標顯著下降(P0.05)。④將HUVECs暴露在200μmol/L的H202中,磷酸化的蛋白—pAkt、p-c-Jun、pERK1/2、p-p38蛋白在30min時表達開始升高,至4-8h表達至峰值(P0.05),故選取4h為通路蛋白檢測時間點。⑤以200μmol/L H2O2處理HUVECs 4h, c-Jun、 ERK1/2、p38、NF-κB、 Nrf2、GSK3β mRNA的表達上調(diào)(P0.05),Akt、SIRT1 mRNA的表達下調(diào)(P0.05)；p-c-Jun、pERK1/2、p-p38、NF-κB、Nrf2、GSK3β蛋白的表達上調(diào)(P0.05),pAkt、SIRT1蛋白的表達下調(diào)(P0.05)；而予30μmol/L的SIRT1激動劑預處理2h后,H2O2對以上基因和蛋白的調(diào)節(jié)作用被逆轉(P0.05)。3.①SIRT1蛋白主要定位于細胞核中。②將HUVECs暴露在200μmol/L的H202中24h,P-Selectin、PSGL-1、vWF和TM mRNA和蛋白的表達顯著上調(diào)(P0.05),而予30μmol/L濃度的SIRT1激動劑預處理2h后,H202對以上基因和蛋白的上調(diào)作用被逆轉(P0.05)。③加入SIRT1特異性抑制劑EX527后,SIRT1對P-Selectin、PSGL-1、vWF和TM mRNA和蛋白的表達不再出現(xiàn)調(diào)控作用(P0.05)。[結論]1.氧化應激反應促進DVT發(fā)生、發(fā)展,PI3-K/Akt/GSK3β、MAPKs(c-Jun、 ERK1/2、p38)、NF-κB、 Nrf2/ARE信號通路參與氧化應激誘導的靜脈內(nèi)皮細胞損傷、凋亡。2. SIRT1通過抑制促凋亡通路(MAPKs)、抑制炎癥反應通路(NF-κB)、激活抗凋亡通路(PI3-K/Akt/GSK3β)修復氧化應激誘導的內(nèi)皮細胞損傷、凋亡。3.過表達SIRT1可抑制內(nèi)皮細胞氧化損傷后促血栓分子P-Selectin、PSGL-1、 vWF和TM基因和蛋白的表達上調(diào),推測其可能成為防治DVT形成的新的作用靶點。
【圖文】：

麻醉試劑：異l#q<。異l#燒（Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）為恩l#燒（Ｅｎｆｌｕｒａｎｅ）的異構體，逡逑無色的澄明液體，易揮發(fā)，具有輕微氣味。它通過動物呼吸吸入肺內(nèi)進入血管，逡逑經(jīng)血液循環(huán)到達大腦，抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可達到止痛和無意識的雙重功效。異逡逑l#燒比恩l#q<更少經(jīng)過生物轉化，幾乎完全由肺清除。這意味著它對肝藥酶系統(tǒng)逡逑的誘導很小，，因此對藥代試驗和毒理試驗干擾最小。加上誘導和復蘇均較快，異逡逑氛q<在動物實驗中日趨廣泛應用。逡逑

ｙ焌邐＾Ｈｋ邐Ｉ逡逑Ｋ邐ＳＨｖ逡逑圖１動物氣體麻醉系統(tǒng)及實驗操作臺逡逑巧ｇ．ｌ邋Ａｎｉｍａｌ邋ａｎｅｓ化ｅｔｉｃ邋ｇａｓ邋ｓｙｓ化ｍ邋ａｎｄ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ邋ｗｏｉ＂ｋ邋ｓｔａｔｉｏｎ逡逑麻醉試劑：異l#q<。異l#燒（Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）為恩l#燒（Ｅｎｆｌｕｒａｎｅ）的異構體，逡逑無色的澄明液體，易揮發(fā)，具有輕微氣味。它通過動物呼吸吸入肺內(nèi)進入血管，逡逑經(jīng)血液循環(huán)到達大腦，抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可達到止痛和無意識的雙重功效。異逡逑l#燒比恩l#q<更少經(jīng)過生物轉化，幾乎完全由肺清除。這意味著它對肝藥酶系統(tǒng)逡逑的誘導很小，因此對藥代試驗和毒理試驗干擾最小。加上誘導和復蘇均較快，異逡逑氛q<在動物實驗中日趨廣泛應用。逡逑
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R543.6

【參考文獻】

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本文編號：2549058