發(fā)布時(shí)間：2017-03-18 15:04

  本文關(guān)鍵詞：siRNA沉默Nrf2基因?qū)撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠急性心肌梗死的影響及機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：核因子E2相關(guān)因子2（Nuclear factor-erythroid2-related factor2, Nrf2）是一種抑制氧化應(yīng)激的轉(zhuǎn)錄因子。本研究采用Nrf2-siRNA㤘EGFP融合基因重組慢病毒載體修飾大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSCs），觀察體外模擬炎性環(huán)境中沉默Nrf2基因?qū)SCs的生物學(xué)特征的影響；同時(shí)在體內(nèi)觀察其對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞參與修復(fù)大鼠急性心肌梗死（Acute myocardial infarction, AMI）的影響及其相關(guān)機(jī)制，以期為心肌梗死后氧化應(yīng)激環(huán)境的改善及心功能的治療探索新的途徑。 方法： 體外實(shí)驗(yàn)：按本課題組成熟的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行MSCs的體外分離、培養(yǎng)及傳代，并收集第三代（P3）細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀技術(shù)鑒定；購(gòu)買攜帶EGFP的Nrf2siRNA慢病毒和空載慢病毒并分別轉(zhuǎn)染MSCs，按實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行或不進(jìn)行缺氧無(wú)糖無(wú)血清缺氧處理6h。實(shí)驗(yàn)分為四組：GFP-LV-MSCsNrf2+/-常氧組（簡(jiǎn)稱MSCsNrf2+/-常氧組）、GFP-LV-MSCsNrf2-/-常氧組（簡(jiǎn)稱MSCsNrf2-/-常氧組）、GFP-LV-MSCsNrf2+/-缺氧組（簡(jiǎn)稱MSCsNrf2+/-缺氧組）、GFP-LV-MSCsNrf2-/-缺氧組（簡(jiǎn)稱MSCsNrf2-/-缺氧組）。分別用熒光表達(dá)、流式細(xì)胞術(shù)確定最佳感染復(fù)數(shù)（Multiplicity of infection, MOI）；Western blot法檢測(cè)各組核蛋白中Nrf2及其下游靶點(diǎn)HO-1的蛋白表達(dá)水平； CCK8法、流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖、凋亡和分化情況；細(xì)胞劃痕試驗(yàn)觀察各組細(xì)胞的遷移能力。 體內(nèi)部分：采用結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支建立大鼠心肌梗死模型，60只大鼠隨即均分為溶劑對(duì)照組（PBS組）、空載慢病毒組（MSCsNrf2+/-組）和Nrf2沉默組（MSCsNrf2-/-組），建模成功后即刻在心肌梗死交界區(qū)不同點(diǎn)注射2×106/0.3ml的細(xì)胞，注射等體積PBS溶液作為對(duì)照。在心肌梗死模型建立后不同時(shí)間點(diǎn)，采用伊紅-蘇木素（Hematoxylin Eosin，HE）染色觀察細(xì)胞移植后心肌病理變化，Masson染色檢測(cè)心肌組織梗死區(qū)膠原纖維改變，TTC染色檢測(cè)心梗面積，細(xì)胞免疫熒光法觀察移植細(xì)胞存活、增殖和分化情況，并行超聲心動(dòng)圖檢查，觀察心功能各項(xiàng)指標(biāo)的變化。采用Western-blot法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌梗死區(qū)Nrf2、HO-1、Bcl-2、Bax和MMP9的蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果： 體外實(shí)驗(yàn)：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，所培養(yǎng)的MSCs中CD29、CD90表達(dá)陽(yáng)性而CD45表達(dá)陰性，符合MSCs特征。Nrf2siRNA-EGFP重組慢病毒轉(zhuǎn)染MSCs最佳MOI值為20，并在轉(zhuǎn)染后72小時(shí)時(shí)綠色熒光蛋白表達(dá)最強(qiáng)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示：與其余各組相比，MSCsNrf2-/-缺氧組的細(xì)胞凋亡率顯著增高（P0.05）。采用CCK8法檢測(cè)各組增殖情況和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組遷移情況，結(jié)果顯示，與常氧組相比，缺氧組的細(xì)胞增殖速率和細(xì)胞遷移率均顯著下降（P0.05）；與MSCsNrf2+/-缺氧組相比，MSCsNrf2-/-缺氧組的細(xì)胞增殖速率和細(xì)胞遷移率也顯著下降（P0.05）。細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)各組CD31表達(dá)情況，結(jié)果顯示，缺氧不能誘導(dǎo)MSCs分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞，且沉默Nrf2對(duì)MSCs內(nèi)CD31的表達(dá)無(wú)顯著影響。Western bolt檢測(cè)各組Nrf2核蛋白和HO-1蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與MSCsNrf2+/-常氧組相比，MSCsNrf2+/-缺氧組表達(dá)水平明顯升高（P0.05）；而與MSCsNrf2+/-缺氧組相比，，MSCsNrf2-/-缺氧組表達(dá)則顯著下降（P0.05）；MSCsNrf2+/-常氧組與MSCsNrf2-/-常氧組組間比較無(wú)顯著差異（P0.05）。 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)： HE、Masson和TTC染色結(jié)果顯示，在心肌梗死模型建立后第28天，與MSCsNrf2+/-組相比，MSCsNrf2-/-組的心肌組織病理病變程度較重（P0.05），梗死面積增大（P0.05），但其與PBS組相比并無(wú)顯著差異（P0.05）。組織免疫熒光結(jié)果顯示，在心肌梗死模型建立后第7天，與MSCsNrf2+/-組相比，MSCsNrf2-/-組凋亡蛋白Caspase3表達(dá)增加。Western blot結(jié)果顯示，與MSCsNrf2+/-相比，MSCsNrf2-/-組梗死區(qū)中Nrf2、HO-1和Bcl-2蛋白表達(dá)下降，Bax、MMP9表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；但其與PBS組相比，各蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示，細(xì)胞移植后第28天，與MSCsNrf2+/-組相比，MSCsNrf2-/-組中LVDd和LVDs值增大、EF值下降（P0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但MSCsNrf2-/-組與PBS組兩組間各指標(biāo)比較均無(wú)顯著性差異（P0.05）。結(jié)論：采用貼壁篩選法可分離獲得高純度的MSCs，且Nrf2siRAN/LV可成功轉(zhuǎn)染入大鼠MSCs并使Nrf2基因表達(dá)顯著減少。沉默Nrf2可促進(jìn)MSCs發(fā)生凋亡，降低其缺氧耐受力，且對(duì)其分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)顯著影響。沉默Nrf2可降低體外模擬炎性環(huán)境中MSCs的增殖速率和遷移速率，但這可能與Nrf2的抗凋亡作用有關(guān)；沉默Nrf2也許并不能直接影響MSCs的增殖和遷移，而是通過(guò)降低MSCs的細(xì)胞活力從而抑制其增殖和遷移。向心肌梗死大鼠心臟內(nèi)移植一定數(shù)量的MSCs可在一定程度上改善心功能，這與Nrf2在所移植的MSCs中發(fā)生核轉(zhuǎn)位密切相關(guān)。沉默Nrf2可降低所移植的BMSCs對(duì)急性梗死心肌氧化應(yīng)激環(huán)境的耐受能力，且不能顯著改善梗死心肌炎性微環(huán)境及心肌梗死大鼠的心臟重構(gòu)和心功能。
【關(guān)鍵詞】：轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)因子2 間充質(zhì)干細(xì)胞 慢病毒載體 干細(xì)胞移植 急性心肌梗死
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R542.22
【目錄】：

• 中英文縮寫詞表5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-12
• 體外實(shí)驗(yàn)12
• 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)12-13
• 前言13-15
• 第一部分：siRNA 沉默 Nrf2 基因?qū)w外模擬炎性環(huán)境中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及潛在機(jī)制研究15-38
• 1 材料與方法15-21
• 2 結(jié)果21-34
• 3 討論34-37
• 4 小結(jié)37-38
• 第二部分：siRNA 沉默 Nrf2 基因?qū)撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠急性心肌梗死的影響及潛在機(jī)制研究38-53
• 1 材料與方法38-41
• 2 結(jié)果41-49
• 3 討論49-52
• 4 小結(jié)52-53
• 全文結(jié)論53-54
• 參考文獻(xiàn)54-60
• 綜述60-72
• 參考文獻(xiàn)66-72
• 致謝72-73
• 作者簡(jiǎn)介73

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 孫海梅;郭濤;王雨平;唐睿珠;駱志玲;申麗娟;;豬缺血再灌注損傷與心肌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J];重慶醫(yī)學(xué);2012年11期

2 薛富善;孫海燕;李平;張國(guó)華;;細(xì)胞凋亡與心肌缺血再灌注損傷[J];中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)刊;2007年04期

3 李俊峽,賈國(guó)良,金明,馬越云,蘇明權(quán),張林;轉(zhuǎn)染bcl-2基因?qū)π募〖?xì)胞活力的影響[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2003年02期

4 鄧宇s

本文編號(hào)：254604