【摘要】：目的:心血管系統(tǒng)疾病(cardiaovascular disease,CVD)是威脅我國公眾健康的頭號殺手,遺憾的是,目前的治療策略只能延緩疾病進展,不能讓失去的心肌細胞再生。近年來,多項臨床前和臨床試驗證明心臟祖/干細胞(cardiac progenitor/stem cells,CPCs/CSCs)治療應(yīng)用于心臟再生修復(fù)是可行的、安全的。使用內(nèi)源性CPCs需要進行心臟活檢,這對于危重患者具有較大的風(fēng)險,因此,需要開發(fā)獲取外源性心臟祖細胞的方法。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)具有低免疫原性、免疫調(diào)節(jié)等優(yōu)勢,已作為自體/同種異體干細胞治療的候選者。從譜系發(fā)育角度看,它和CPCs同起源于中胚層。BM-MSCs向心臟祖細胞方向誘導(dǎo)的重編程技術(shù),將克服它低心臟分化潛能的缺陷,使之成為心臟修復(fù)的理想細胞類型。然而,在重編程過程中,染色質(zhì)狀態(tài)被認為是跨越細胞表型的最大障礙。所以,尋找新的染色質(zhì)重塑因子是提高心臟祖細胞重編程效率的突破口。本研究探究AF9在蛋白質(zhì)重編程BM-MSCs生成心臟祖細胞中的作用及其表觀遺傳調(diào)控機制。研究方法:1.將pSmartI-MLLT3表達載體,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達菌株中,優(yōu)化AF9-His融合蛋白表達條件,利用親和層析柱純化AF9蛋白;2.用納米蛋白轉(zhuǎn)染載體(CN 201410823369.2)修飾重組蛋白GATA4、TBX5、NKX2.5、AF9,然后與BM-MSCs孵育12小時,免疫熒光染色觀察納米載體遞送效率;3.以BM-MSCs為起始重編程對象,設(shè)置空載體組、GNT(GATA4、NKX2.5、TBX5)組和 GNTA(GATA4、NKX2.5、TBX5、AF9)重編程組。重編程第 8天,用qPCR檢測各組心臟祖細胞標志性基因ISL1、FLK1、NKX2.5、GATA4 mRNA表達水平,評估AF9蛋白在獲取心臟祖細胞(protein induced cardiac progenitor-like cells,piCPCs)中的作用。利用免疫熒光、流式細胞術(shù)檢測重編程因子GNTA的重編程效率及piCPCs的心臟分化潛能。選取d0、d4、d8、d16四個重編程時間點,采用qPCR、Western Blot檢測心臟祖細胞標志物的mRNA、蛋白質(zhì)表達情況;4.利用免疫共沉淀技術(shù)和免疫熒光共定位技術(shù)檢測AF9與GATA4之間的相互作用,采用Western Blot技術(shù)檢測GNTA重編程過程中組蛋白甲基化修飾水平。構(gòu)建shRNA-DOT1L載體以及建立穩(wěn)定細胞株,用ChIP-qPCR技術(shù)檢測重編程第8天CPCs標志基因MYH6、MYH7啟動子區(qū)域的H3K79me2富集程度。結(jié)果:1.在BL21(DE3)菌株中成功誘導(dǎo)人源重組蛋白AF9表達,純度達到90%以上;2.納米蛋白轉(zhuǎn)染試劑修飾后的重編程因子GATA4、TBX5、NKX2.5、AF9能高效轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞核,效率達到95%以上;3.與GNT組相比,添加AF9蛋白能顯著性提高GATA4(P0.001)、ISL1(P0.05)轉(zhuǎn)錄水平。BM-MSCs經(jīng)GNTA誘導(dǎo),8天后可見“玫瑰花環(huán)”樣細胞集落形成。ISL1+/TBX5+ piCPCs 占 85.20±3.13%(n=3),誘導(dǎo)產(chǎn)生的 piCPCs具有向心肌細胞、血管平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞定向分化的潛能。qPCR、Western Blot結(jié)果顯示,CPCs標志物隨著誘導(dǎo)時間的延長而表達增加,其中CPCs早期標志物ISL1、NKX2.5第8天mRNA水平到達高峰。4.Co-IP結(jié)果顯示AF9與GATA4存在相互作用,激光共聚焦觀察到AF9和GATA4在細胞核內(nèi)共定位表達。經(jīng)GNTA誘導(dǎo)后,H3K79me2水平明顯上調(diào)。shDOT1L-2載體成功沉默DOT1L的表達,顯著性抑制H3K79雙甲基化。ChIP-qPCR結(jié)果顯示了 DOT1L的沉默,削弱了MYH MYH7啟動子區(qū)域H3K79me2的富集。結(jié)論:AF9可作為有效的重編程因子,促進心臟轉(zhuǎn)錄因子組合GNT誘導(dǎo)BM-MSCs重編程為CPCs,其可能的機制是AF9招募了 DOT1L,在GATA4-AF9復(fù)合物的引導(dǎo)下,促進心臟關(guān)鍵基因啟動子區(qū)域的組蛋白H3K79發(fā)生二甲基化,激活下游相關(guān)基因的表達。因此,表觀遺傳調(diào)控因子AF9在骨髓間充質(zhì)干細胞向心臟祖細胞重編程過程起著重要的促進作用,本研究優(yōu)化了蛋白質(zhì)重編程因子組合,提供了一種新的、有效地獲取外源心臟祖細胞的方法,為臨床轉(zhuǎn)化創(chuàng)制心肌補片、藥物評價奠定研究基礎(chǔ)。
【圖文】：

Ｒｏｃｈｅ廣州化學(xué)試劑廠廣州化學(xué)試劑廠廣州化學(xué)試劑廠廣州化學(xué)試劑廠廣州化學(xué)試劑廠１００邐廣州化學(xué)試劑廠廣州化學(xué)試劑廠廣州化學(xué)試劑廠用ＪＣＡＴ在線軟件對ＭＺＸ７３邋（ＮＣＢＩ的Ｇｅｎｅ邋１Ｄ邋４３００）基因的氨優(yōu)化，由常州天地人和生物科技有限公司設(shè)計全長拼接引物，切位點ＡＷｄ和７／／？ｄＩＩＩ將合成的ＭＬＬ７３基因（ＭＩＬ７３序列見附Ｓｍａｒｔｌ載體中（ｐＳｍａｒｔｌ載體圖譜見圖卜１邋）。逡逑

克隆子培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，Ａ＾ｅｌ／／／／？ｄｉｎ雙酶切鑒定，環(huán)狀的質(zhì)粒被切斷。酶切前逡逑后的質(zhì)粒進行０．７％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果在１５００ｂｐ和２０００ｂｐ間可見一條逡逑清晰的片斷（圖１－２），推測為表達載體ｐＳｍａｒｔｌ連接的約１７３７ｂｐ的目標基因逡逑ＭＬＬ７３。將雙酶切鑒定正確的ｐＳｍａｒｔＩ－ＭＬＬＴ３質(zhì)粒送到英濰捷基（上海）貿(mào)易逡逑有限公司測序，部分測序結(jié)果見圖１－３。經(jīng)測序比對，，測序結(jié)果與預(yù)期目標基因逡逑序列１００％匹配。逡逑５，０００ｂｐ逡逑３ｔ０００ｂｐ逡逑２，Ｑ００ｂｐｌＷ逡逑１，５００ｂｐ＾＾ｌ逡逑ｌ，ＯＯＯｂｐ逡逑５００ｂｐ逡逑２５０ｂｐ＾Ｈ逡逑ｌＯＯｂｐＨ逡逑圖１－２．重組質(zhì)粒ｐＳｍａｒｔ丨－ＭＬＬＴ３的酶切鑒定逡逑Ｍ，邋５０００ｂｐＤＮＡＭａｒｋｅｒ；邋１，酶切前質(zhì)粒；２，邋ＡＷｅＩ／／＾ｄＩＩＩ邋酶切后質(zhì)粒。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ａｇａｒｏｓｅ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ｐＳｍａｒｔＩ－ＭＬＬＴ３邋ｐｌａｓｍｉｄｓ邋ｄｉｇｅｓｔｅｄ邋ｂｙ邋ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ逡逑ｅｎｚｙｍｅｓ逡逑Ｍ：５０００ｂｐ邋ＤＮＡ邋ｌａｄｄｅｒ．邋１，邋ｐＳｍａｒｔＩ－ＭＬＬＴ３．邋２，邋ｐＳｍａｒｔＩ－ＭＬＬＴ３邋ｄｉｇｅｓｔｅｄ邋ｗｉｔｈＡＷ＾Ｉ邋／Ｈｉｎｄｌｌｌ．逡逑１４逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R54

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本文編號：2540359