【摘要】：目的:心血管系統(tǒng)疾病(cardiaovascular disease,CVD)是威脅我國(guó)公眾健康的頭號(hào)殺手,遺憾的是,目前的治療策略只能延緩疾病進(jìn)展,不能讓失去的心肌細(xì)胞再生。近年來(lái),多項(xiàng)臨床前和臨床試驗(yàn)證明心臟祖/干細(xì)胞(cardiac progenitor/stem cells,CPCs/CSCs)治療應(yīng)用于心臟再生修復(fù)是可行的、安全的。使用內(nèi)源性CPCs需要進(jìn)行心臟活檢,這對(duì)于危重患者具有較大的風(fēng)險(xiǎn),因此,需要開(kāi)發(fā)獲取外源性心臟祖細(xì)胞的方法。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)具有低免疫原性、免疫調(diào)節(jié)等優(yōu)勢(shì),已作為自體/同種異體干細(xì)胞治療的候選者。從譜系發(fā)育角度看,它和CPCs同起源于中胚層。BM-MSCs向心臟祖細(xì)胞方向誘導(dǎo)的重編程技術(shù),將克服它低心臟分化潛能的缺陷,使之成為心臟修復(fù)的理想細(xì)胞類(lèi)型。然而,在重編程過(guò)程中,染色質(zhì)狀態(tài)被認(rèn)為是跨越細(xì)胞表型的最大障礙。所以,尋找新的染色質(zhì)重塑因子是提高心臟祖細(xì)胞重編程效率的突破口。本研究探究AF9在蛋白質(zhì)重編程BM-MSCs生成心臟祖細(xì)胞中的作用及其表觀遺傳調(diào)控機(jī)制。研究方法:1.將pSmartI-MLLT3表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌株中,優(yōu)化AF9-His融合蛋白表達(dá)條件,利用親和層析柱純化AF9蛋白;2.用納米蛋白轉(zhuǎn)染載體(CN 201410823369.2)修飾重組蛋白GATA4、TBX5、NKX2.5、AF9,然后與BM-MSCs孵育12小時(shí),免疫熒光染色觀察納米載體遞送效率;3.以BM-MSCs為起始重編程對(duì)象,設(shè)置空載體組、GNT(GATA4、NKX2.5、TBX5)組和 GNTA(GATA4、NKX2.5、TBX5、AF9)重編程組。重編程第 8天,用qPCR檢測(cè)各組心臟祖細(xì)胞標(biāo)志性基因ISL1、FLK1、NKX2.5、GATA4 mRNA表達(dá)水平,評(píng)估AF9蛋白在獲取心臟祖細(xì)胞(protein induced cardiac progenitor-like cells,piCPCs)中的作用。利用免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)重編程因子GNTA的重編程效率及piCPCs的心臟分化潛能。選取d0、d4、d8、d16四個(gè)重編程時(shí)間點(diǎn),采用qPCR、Western Blot檢測(cè)心臟祖細(xì)胞標(biāo)志物的mRNA、蛋白質(zhì)表達(dá)情況;4.利用免疫共沉淀技術(shù)和免疫熒光共定位技術(shù)檢測(cè)AF9與GATA4之間的相互作用,采用Western Blot技術(shù)檢測(cè)GNTA重編程過(guò)程中組蛋白甲基化修飾水平。構(gòu)建shRNA-DOT1L載體以及建立穩(wěn)定細(xì)胞株,用ChIP-qPCR技術(shù)檢測(cè)重編程第8天CPCs標(biāo)志基因MYH6、MYH7啟動(dòng)子區(qū)域的H3K79me2富集程度。結(jié)果:1.在BL21(DE3)菌株中成功誘導(dǎo)人源重組蛋白AF9表達(dá),純度達(dá)到90%以上;2.納米蛋白轉(zhuǎn)染試劑修飾后的重編程因子GATA4、TBX5、NKX2.5、AF9能高效轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核,效率達(dá)到95%以上;3.與GNT組相比,添加AF9蛋白能顯著性提高GATA4(P0.001)、ISL1(P0.05)轉(zhuǎn)錄水平。BM-MSCs經(jīng)GNTA誘導(dǎo),8天后可見(jiàn)“玫瑰花環(huán)”樣細(xì)胞集落形成。ISL1+/TBX5+ piCPCs 占 85.20±3.13%(n=3),誘導(dǎo)產(chǎn)生的 piCPCs具有向心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞定向分化的潛能。qPCR、Western Blot結(jié)果顯示,CPCs標(biāo)志物隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而表達(dá)增加,其中CPCs早期標(biāo)志物ISL1、NKX2.5第8天mRNA水平到達(dá)高峰。4.Co-IP結(jié)果顯示AF9與GATA4存在相互作用,激光共聚焦觀察到AF9和GATA4在細(xì)胞核內(nèi)共定位表達(dá)。經(jīng)GNTA誘導(dǎo)后,H3K79me2水平明顯上調(diào)。shDOT1L-2載體成功沉默DOT1L的表達(dá),顯著性抑制H3K79雙甲基化。ChIP-qPCR結(jié)果顯示了 DOT1L的沉默,削弱了MYH MYH7啟動(dòng)子區(qū)域H3K79me2的富集。結(jié)論:AF9可作為有效的重編程因子,促進(jìn)心臟轉(zhuǎn)錄因子組合GNT誘導(dǎo)BM-MSCs重編程為CPCs,其可能的機(jī)制是AF9招募了 DOT1L,在GATA4-AF9復(fù)合物的引導(dǎo)下,促進(jìn)心臟關(guān)鍵基因啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白H3K79發(fā)生二甲基化,激活下游相關(guān)基因的表達(dá)。因此,表觀遺傳調(diào)控因子AF9在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心臟祖細(xì)胞重編程過(guò)程起著重要的促進(jìn)作用,本研究?jī)?yōu)化了蛋白質(zhì)重編程因子組合,提供了一種新的、有效地獲取外源心臟祖細(xì)胞的方法,為臨床轉(zhuǎn)化創(chuàng)制心肌補(bǔ)片、藥物評(píng)價(jià)奠定研究基礎(chǔ)。
【圖文】：

Ｒｏｃｈｅ廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)１００邐廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)用ＪＣＡＴ在線(xiàn)軟件對(duì)ＭＺＸ７３邋（ＮＣＢＩ的Ｇｅｎｅ邋１Ｄ邋４３００）基因的氨優(yōu)化，由常州天地人和生物科技有限公司設(shè)計(jì)全長(zhǎng)拼接引物，切位點(diǎn)ＡＷｄ和７／／？ｄＩＩＩ將合成的ＭＬＬ７３基因（ＭＩＬ７３序列見(jiàn)附Ｓｍａｒｔｌ載體中（ｐＳｍａｒｔｌ載體圖譜見(jiàn)圖卜１邋）。逡逑

克隆子培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，Ａ＾ｅｌ／／／／？ｄｉｎ雙酶切鑒定，環(huán)狀的質(zhì)粒被切斷。酶切前逡逑后的質(zhì)粒進(jìn)行０．７％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果在１５００ｂｐ和２０００ｂｐ間可見(jiàn)一條逡逑清晰的片斷（圖１－２），推測(cè)為表達(dá)載體ｐＳｍａｒｔｌ連接的約１７３７ｂｐ的目標(biāo)基因逡逑ＭＬＬ７３。將雙酶切鑒定正確的ｐＳｍａｒｔＩ－ＭＬＬＴ３質(zhì)粒送到英濰捷基（上海）貿(mào)易逡逑有限公司測(cè)序，部分測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖１－３。經(jīng)測(cè)序比對(duì)，，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期目標(biāo)基因逡逑序列１００％匹配。逡逑５，０００ｂｐ逡逑３ｔ０００ｂｐ逡逑２，Ｑ００ｂｐｌＷ逡逑１，５００ｂｐ＾＾ｌ逡逑ｌ，ＯＯＯｂｐ逡逑５００ｂｐ逡逑２５０ｂｐ＾Ｈ逡逑ｌＯＯｂｐＨ逡逑圖１－２．重組質(zhì)粒ｐＳｍａｒｔ丨－ＭＬＬＴ３的酶切鑒定逡逑Ｍ，邋５０００ｂｐＤＮＡＭａｒｋｅｒ；邋１，酶切前質(zhì)粒；２，邋ＡＷｅＩ／／＾ｄＩＩＩ邋酶切后質(zhì)粒。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ａｇａｒｏｓｅ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ｐＳｍａｒｔＩ－ＭＬＬＴ３邋ｐｌａｓｍｉｄｓ邋ｄｉｇｅｓｔｅｄ邋ｂｙ邋ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ逡逑ｅｎｚｙｍｅｓ逡逑Ｍ：５０００ｂｐ邋ＤＮＡ邋ｌａｄｄｅｒ．邋１，邋ｐＳｍａｒｔＩ－ＭＬＬＴ３．邋２，邋ｐＳｍａｒｔＩ－ＭＬＬＴ３邋ｄｉｇｅｓｔｅｄ邋ｗｉｔｈＡＷ＾Ｉ邋／Ｈｉｎｄｌｌｌ．逡逑１４逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R54

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10 彭正軍;劉路;凌均h

本文編號(hào)：2540359