【摘要】：背景:心血管疾病(CVDs)是心臟和血管疾患引起的一組循環(huán)系統(tǒng)疾病,是目前全球人類死亡的首要原因,其發(fā)病率和死亡率一直呈上升趨勢(shì),已超過腫瘤性疾病而躍居第一,且其中一半以上發(fā)生在亞洲國(guó)家。CVDs發(fā)病率存在性別差異,即絕經(jīng)后婦女CVDs的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較同齡男性和絕經(jīng)前婦女顯著增加,這種差異與卵巢性激素對(duì)心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用息息相關(guān)。健康婦女在圍絕經(jīng)期早期,內(nèi)皮功能就開始下降,且其障礙程度與CVDs的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生功能障礙后,可表達(dá)免疫球蛋白超家族黏附分子(VCAM-1、ICAM-1等)、選擇素家族成員(E-selectin、P-selectin等)以及分泌TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MIP、MCP-1等炎癥介質(zhì),共同參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展過程中的每個(gè)重要環(huán)節(jié)。研究表明,不論是自然絕經(jīng)還是人為去勢(shì)都可導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)慢性炎癥反應(yīng),并伴隨血清IL-8、MCP-1、MIP-1α、RANTES升高。又有研究表明,絕經(jīng)后婦女自主神經(jīng)系統(tǒng)功能發(fā)生紊亂,表現(xiàn)為迷走神經(jīng)活動(dòng)降低、交感神經(jīng)活動(dòng)升高。而作為自主神經(jīng)系統(tǒng)主要組成部分的迷走神經(jīng),可參與調(diào)控機(jī)體的炎癥反應(yīng),并有學(xué)者將迷走神經(jīng)及其遞質(zhì)乙酰膽堿(ACh)與免疫系統(tǒng)相互作用參與抗炎的神經(jīng)-免疫調(diào)節(jié)通路命名為“膽堿能抗炎通路(CAP)”。我室前期研究也發(fā)現(xiàn),迷走神經(jīng)活動(dòng)增加后可顯著減輕結(jié)腸黏膜的炎癥反應(yīng)。故我們推測(cè):絕經(jīng)后婦女出現(xiàn)的血管內(nèi)皮細(xì)胞激活和炎癥反應(yīng)可能與自主神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂導(dǎo)致的免疫異常調(diào)節(jié)有關(guān)。研究表明,迷走神經(jīng)傳出纖維末梢釋放的ACh可通過激活免疫細(xì)胞表面α7n ACh R,調(diào)控NF-κB/p65的核轉(zhuǎn)位過程,抑制編碼促炎細(xì)胞因子和趨化因子基因的轉(zhuǎn)錄。此外,MAPKs信號(hào)通路可直接或間接影響編碼促炎細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄過程,而IκB的磷酸化和NF-κB/p65的磷酸化、核轉(zhuǎn)位被認(rèn)為是其下游最重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一。我室前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),生物反饋可有效改善交感-迷走平衡,增強(qiáng)迷走神經(jīng)活動(dòng)、減弱交感神經(jīng)活動(dòng)。故我們提出假設(shè):生物反饋可通過增強(qiáng)迷走神經(jīng)活動(dòng)調(diào)節(jié)自主神經(jīng)內(nèi)在平衡(迷走-交感平衡),在一定程度上激活CAP,進(jìn)而減輕絕經(jīng)后婦女血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷、抑制炎性細(xì)胞因子的合成和釋放并最終降低絕經(jīng)后婦女CVDs的患病率和死亡率;而其內(nèi)在機(jī)制則可能與n ACh R的激活和MAPKs、NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控有關(guān)為驗(yàn)證上述科學(xué)假說,我們進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。然而,由于生物反饋等認(rèn)知行為療法的順利開展往往需要高級(jí)神經(jīng)中樞的主動(dòng)參與,其機(jī)制也相當(dāng)復(fù)雜,依據(jù)目前的研究現(xiàn)狀,我們尚不能在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中完全模擬人體生物反饋訓(xùn)練的全過程。故我室王庭槐教授在前期研究的基礎(chǔ)上,首次提出:增強(qiáng)迷走神經(jīng)活動(dòng)可部分模擬生物反饋過程中迷走神經(jīng)活動(dòng)增加的外周反應(yīng),并以此為切入點(diǎn),開始在多種動(dòng)物疾病模型中研究生物反饋增強(qiáng)迷走神經(jīng)活動(dòng)的外周機(jī)制。在本課題的研究中,我們通過切除雌性育齡期大鼠雙側(cè)卵巢來模擬女性絕經(jīng)后狀態(tài),同時(shí)采用慢性迷走神經(jīng)刺激來增加迷走神經(jīng)活動(dòng),研究迷走神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng)對(duì)大鼠絕經(jīng)去勢(shì)模型的外周血管保護(hù)作用和抗炎效應(yīng),并結(jié)合體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)探討其可能機(jī)制。目的:研究慢性迷走神經(jīng)刺激對(duì)大鼠絕經(jīng)去勢(shì)模型外周血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用和抗炎效應(yīng),并探討n ACh R和MAPKs、NF-κB信號(hào)通路在其中的作用。第1章:慢性迷走神經(jīng)刺激對(duì)去勢(shì)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制初探1.本部分實(shí)驗(yàn)對(duì)象為:7~8月育齡期SD雌性大鼠;具體分組如下:假手術(shù)組(sham-OVX)(n=9)、去勢(shì)組(OVX)(n=10)、去勢(shì)+假刺激組(OVX+sham-VNS)(n=10)和去勢(shì)+刺激組(OVX+VNS)(n=9)。2.結(jié)合我室前期工作基礎(chǔ),在OVX和OVX+sham VNS組建立大鼠絕經(jīng)去勢(shì)模型;sham-OVX組也要接受去勢(shì)手術(shù),但不摘除卵巢;同時(shí)在OVX+sham-VNS和OVX+VNS組大鼠左側(cè)頸部迷走神經(jīng)干植入刺激電極,建立慢性迷走神經(jīng)刺激(VNS)動(dòng)物模型。OVX+VNS組每?jī)商旖邮躒NS干預(yù)一次,刺激參數(shù)為:連續(xù)單刺激,刺激頻率20.0Hz,電流1.0m A,波寬10.0 ms,每次干預(yù)3h。OVX+sham-VNS組除不接受刺激外,其他處理同OVX+VNS組。3.于實(shí)驗(yàn)前后分別測(cè)量所有大鼠體重和血壓水平;建立模型成功后正常飼養(yǎng)13周,每天記錄體重變化情況;實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,取大鼠血清、胸主動(dòng)脈、心臟和子宮,觀察大鼠一般情況的變化。4.HE染色后鏡下觀察大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的病理形態(tài)改變;透射電鏡和掃描電鏡觀察大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。5.離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)觀察大鼠內(nèi)皮細(xì)胞完整的胸主動(dòng)脈舒張功能。6.采用可見分光光度法和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn),檢測(cè)大鼠胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮e-NOS表達(dá)、NO含量、血清ET-1和NO的水平以及主動(dòng)脈管壁ACh的含量。第2章:慢性迷走神經(jīng)刺激對(duì)去勢(shì)大鼠炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用1.本部分實(shí)驗(yàn)對(duì)象為:7~8月育齡期SD雌性大鼠和體外培養(yǎng)的HUVECs;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組如下:sham-OVX、OVX、OVX+sham-VNS和OVX+VNS;體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)采用100 ng/ml LPS與HUVECs共孵育8h,建立血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥模型。方法:2.采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(VCAM-1、ICAM-1、E-selectin)的表達(dá)。3.采用免疫印跡方法觀察ACh(10-9~10-5M)預(yù)孵育24h后,對(duì)LPS誘導(dǎo)的HUVECs黏附分子(VCAM-1、ICAM-1、E-selectin)表達(dá)的影響。4.采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠血清和HUVECs上清炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6、IL-8、CINC/KC、MCP-1)的水平。第3章:MAPKs、NF-κB信號(hào)通路在慢性迷走神經(jīng)刺激減輕去勢(shì)大鼠炎癥反應(yīng)中的作用及機(jī)制研究1.體外培養(yǎng)HUVECs,利用100 ng/ml LPS與HUVECs共孵育8h,建立血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥模型。2.采用免疫印跡方法分析α7n ACh R特異性阻斷劑甲基牛扁堿(MLA)和n ACh R非特異性阻斷劑美加明(mec)對(duì)ACh降低LPS誘導(dǎo)的黏附分子表達(dá)的影響。3.采用免疫組織化學(xué)染色法和免疫印跡方法,觀察血管壁NF-κB/p65的表達(dá)和核轉(zhuǎn)位。4.采用免疫印跡方法檢測(cè)HUVECs NF-κB/p65、p-NF-κB/p65、IκB、p-IκB、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白分子的表達(dá)。結(jié)果:第1章:慢性迷走神經(jīng)刺激對(duì)去勢(shì)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制初探1.大鼠切除卵巢13周后:掃描電鏡結(jié)果顯示,血管內(nèi)膜出現(xiàn)明顯的損傷,表現(xiàn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞的萎縮、變形、脫落以及大量纖維蛋白黏附至內(nèi)皮表面;透射電鏡結(jié)果顯示,血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的損傷,表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、線粒體腫脹、胞質(zhì)液化,以及內(nèi)皮細(xì)胞壞死,內(nèi)彈力膜厚薄不均、斷裂等;而去勢(shì)大鼠接受慢性VNS干預(yù)后可顯著減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。提示:慢性迷走神經(jīng)刺激可顯著改善去勢(shì)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的異常改變。2.與去勢(shì)大鼠相比,OVX+VNS組大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)對(duì)ACh(10-9~10-5 M)誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞最大舒張率顯著增加,接近正常對(duì)照組。提示:慢性迷走神經(jīng)刺激可顯著改善去勢(shì)大鼠血管內(nèi)皮依賴性舒張功能障礙。3.與去勢(shì)大鼠相比,OVX+VNS組大鼠血管壁內(nèi)皮e-NOS表達(dá)、NO含量顯著增加,血清ET-1的水平顯著降低,接近正常對(duì)照組;且OVX+VNS組大鼠血管壁ACh含量較sham-OVX、OVX、OVX+sham-VNS組顯著增加。提示:慢性迷走神經(jīng)刺激減弱去勢(shì)大鼠內(nèi)皮細(xì)胞損傷、改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的機(jī)制可能與血管壁內(nèi)皮e-NOS表達(dá)升高、NO產(chǎn)生增多、血清ET-1的水平降低有關(guān),且該效應(yīng)可能與迷走神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng)后外周釋放的ACh增多有關(guān)。第2章:慢性迷走神經(jīng)刺激對(duì)去勢(shì)大鼠炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用1.與去勢(shì)大鼠相比,OVX+VNS組大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(VCAM-1、ICAM-1、E-selectin)的表達(dá)降低,接近正常對(duì)照組。2.與去勢(shì)大鼠相比,OVX+VNS組大鼠血清炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6、IL-8、MCP-1)的水平顯著降低,接近正常對(duì)照組。3.在體外培養(yǎng)的HUVECs中,ACh(10-9~10-5 M)可濃度依賴性降低LPS誘導(dǎo)的黏附分子(VCAM-1、ICAM-1、E-selectin)的表達(dá);其中以10-6和10-5 M ACh的效果最為明顯。4.在體外培養(yǎng)的HUVECs中,ACh(10-9~10-5 M)可濃度依賴性降低LPS誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6、IL-8、MCP-1)的釋放;其中也以10-6和10-5 M ACh的效果最為明顯。1.特異性阻斷α7n ACh R受體,不能阻斷ACh降低LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(VCAM-1)表達(dá)的效應(yīng);而非特異性阻斷n ACh R可顯著阻斷ACh降低LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(VCAM-1)表達(dá)的效應(yīng)。2.與正常對(duì)照組相比,去勢(shì)大鼠血管壁NF-κB/p65的表達(dá)顯著增多、NF-κB/p65亞基的核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象也較明顯;而接受慢性VNS干預(yù)的大鼠,血管壁NF-κB/p65的表達(dá)量和核轉(zhuǎn)位恢復(fù)正常,接近正常對(duì)照組。3.在體外培養(yǎng)的HUVECs中,ACh(10-6 M)可顯著降低LPS誘導(dǎo)的NF-κB/p65、IκB、ERK、JNK、p38MAPK蛋白分子的磷酸化。第3章:MAPKs、NF-κB信號(hào)通路在慢性迷走神經(jīng)刺激減輕去勢(shì)大鼠炎癥反應(yīng)中的作用及機(jī)制研究結(jié)論:1.慢性迷走神經(jīng)刺激可顯著減輕去勢(shì)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷、改善血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙;其機(jī)制可能與迷走神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng)后,血管局部乙酰膽堿釋放增加引起的血管內(nèi)皮e-NOS表達(dá)和NO含量增多、血清ET-1水平下降有關(guān)。2.慢性迷走神經(jīng)刺激可顯著減輕去勢(shì)大鼠血管內(nèi)皮黏附分子(VCAM-1、ICAM-1、E-selectin)的表達(dá)和血清炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6、CINC/KC、MCP-1)的水平。提示:慢性迷走神經(jīng)刺激可減輕去勢(shì)大鼠的血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng),其機(jī)制可能與迷走神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng)后血管局部乙酰膽堿釋放增加,進(jìn)而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活有關(guān)。3.MAPKs(ERK、JNK、p38MAPK)、NF-κB信號(hào)通路共同參與慢性迷走神經(jīng)刺激減輕去勢(shì)大鼠血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)的作用,且該過程可能由n ACh R所介導(dǎo)。
【圖文】：

通過肝臟油紅 O 染色后，我們發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組（圖1-1A）相比，OVX 組（圖 1-1B）和 OVX+sham-VNS 組（圖 1-1C）大鼠肝臟內(nèi)出現(xiàn)大量脂質(zhì)積聚（脂滴可被油紅染成紅色），，而去勢(shì)后就接受慢性 VNS 干預(yù)（OVX+ VNS 組）（圖 1-1D）的大鼠則沒有出現(xiàn)這一現(xiàn)象。提示：正常育齡期雌性大鼠在雙側(cè)卵巢切除 3 個(gè)月后，血清脂質(zhì)代謝暫時(shí)不受影響，而肝臟脂質(zhì)代謝明顯出現(xiàn)紊亂。HE 染色也進(jìn)一步證實(shí)了這一效應(yīng)（圖 1-1E-H）。Total cholesterol (mmol/L)Triglyceride ( mmol/L)HDL-C ( mmol/L)LDL- C( mmol/L1.53±0.060.96±0.210.74±0.040.23±0.041.34±0.190.77±0.210.57±0.110.35±0.022.07±0.440.32±0.080.78±0.100.35±0.061.87±0.420.48±0.100.78±0.140.34±0.06The results were expressed as mean±SEM. All P values were obtained by one-way ANOVA analysis.* Significant differences when compared with the sham-OVX group, P<0.05.#Significant differences when compared with the OVX+VNS group, P<0.05.BW: Body Wight; UW: Uterus Weight; HW: Heart Weight; sham-OVX: sham-ovariectomied; OVX:ovariectomied; OVX+sham-VNS: ovariectomied and sham-vagus nerve stimulation; OVX+VNS: ovariectomiedand vagus nerve stimulation

圖 1-2 慢性迷走神經(jīng)刺激對(duì)去勢(shì)大鼠收縮壓的影響Figure 1-2: Effect of chronic vagus nerve stimulation on systolic blood pressure (SBin ovariectomized rats.SBP was measured pre-experiment and post-experiment in the sham-OVX, OVOVX+sham-VNS, and OVX+VNS rats. Values are expressed as the mean ±S.E.M. (n =At the beginning of the study, there were no differences in SBP among the four grouHowever, post-experiment SBP was significantly higher in the OVX and OVX+sham-Vrats than in sham-OVX and OVX+VNS rats, and it was higher than the pre-experimlevels in the same rats (*P<0.05,#P<0.05). sham-OVX: sham-ovariectomized; OVovariectomized; OVX+sham-VNS: ovariectomized and sham-vagus nerve stimulatiOVX+VNS: ovariectomized and vagus nerve stimulation.
【學(xué)位授予單位】：中山大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R54


本文編號(hào)：2538908