發(fā)布時間：2019-09-11 07:47

【摘要】：研究背景:肺動脈高壓[1](Pulmonary arterial hypertension,PAH)是以肺血管阻力進行性升高為特征的一組疾病,常伴有右心室的肥厚及擴張,致殘率及病死率高,除了傳統(tǒng)的藥物治療外,基因治療、活體肺移植等新的治療手段逐漸出現(xiàn),但仍嚴(yán)重威脅人類健康。其中缺氧引起的肺動脈高壓,多由慢性阻塞性肺疾病、支氣管擴張等疾病引起。肺血管重構(gòu)[2](Pulmonary vascular remodeling,PVR)學(xué)說認(rèn)為低氧條件下,肺動脈中存在的肺血管內(nèi)皮細胞及肺動脈平滑肌細胞(Pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)的異常增殖及凋亡。自噬作為細胞內(nèi)維持穩(wěn)態(tài)的重要途徑,在肺血管重構(gòu)中有重要調(diào)節(jié)作用[3]。目前,肺動脈平滑肌細胞在肺血管重構(gòu)中的自噬的改變尚不十分明確。Fip200作為重要的自噬基因,通過研究Fip200在肺血管重構(gòu)中的作用,有望為PAH的機制研究找到新方向。納米技術(shù)作為新興技術(shù)在醫(yī)學(xué)醫(yī)用領(lǐng)域有寬闊前景,特別是作為運載載體,能高效轉(zhuǎn)運藥物。小RNA作為重要的RNA,能調(diào)控基因的表達,是基因治療的重要方法,但因其運載方式受限,影響其進一步應(yīng)用。將基因治療與納米技術(shù)融合,可改善小RNA的轉(zhuǎn)運問題。DNA納米材料有別于傳統(tǒng)的脂質(zhì)體、病毒、高分子聚合物等傳統(tǒng)的納米材料,可利用DNA雜交原理,實現(xiàn)自組裝,簡單、可控,且本身具有無毒、無免疫源性的特點[4]。核酸適配體是以核酸為基礎(chǔ),能特意識別細胞的物質(zhì)。因此,設(shè)計轉(zhuǎn)載核酸適配體的自組裝DNA納米材料,為基因治療建立運載平臺。因此,我們設(shè)計了一種由三種DNA單鏈攜帶Fip200siRNA,通過DNA-RNA雜交技術(shù),組裝成的新型三角板材料。通過凝膠電泳,驗證其合成效率。通過RT-PCR及Westernblot檢測其對目的基因的干擾作用,研究低氧條件下Fip200在肺血管平滑肌異常增殖及凋亡中的作用,以及低氧條件下Fip200對于TGF-β通路的作用。研究目的:1.合成一種新型的攜帶si RNA的DNA三角板運載體,檢測其對在PASMCs中的轉(zhuǎn)運效率。2.研究低氧條件下Fip200對PASMCs的增殖、凋亡及表型轉(zhuǎn)化的影響。3.探討低氧條件下Fip200影響PASMCs的增殖、凋亡及表型轉(zhuǎn)化的機制。研究方法:1.DNA自組裝三角板納米材料的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)運效率的研究。(1)構(gòu)建攜帶Fip200si RNA的DNA三角板納米材料,通過凝膠電泳檢測其產(chǎn)率,通過激光共聚焦及流式細胞術(shù)檢測其轉(zhuǎn)染效率。(2)使用RT-PCR及Westernblot檢測攜帶Fip200si RNA的DNA三角板納米材料對PASMCs細胞中Fip200基因表達的干擾效果。2.培養(yǎng)大鼠肺動脈平滑肌細胞,檢測低氧條件下PASMCs增殖凋亡的改變及Fip200siRNA對其影響。(1)使用Westernblot檢測低氧條件下PASMCs增殖、凋亡及自噬的改變。(2)采用流式細胞術(shù)及MTT檢測Fip200siRNA對低氧條件下PASMCs增殖、凋亡的影響。(3)使用WB檢測Fip200siRNA對PASMCs細胞中TGF-β的影響。研究結(jié)果:1.構(gòu)建了攜帶Fip200si RNA的DNA三角板納米材料,并轉(zhuǎn)載了PASMCs的核酸適配體,通過非變性凝膠電泳,驗證其自組裝的效率。2.通過WB及RT-PCR的方法,驗證攜帶Fip200siRNA的DNA三角板納米材料對于PASMCs中Fip200的抑制效率,明顯降低了目的基因在mRNA及蛋白水平的表達。3.低氧條件下,PASMCs存在增殖的高表達及凋亡的低表達狀態(tài),并存在高水平自噬的狀態(tài)。4.攜帶Fip200siRNA的DNA三角板納米材料轉(zhuǎn)染PASMCs后,有效的抑制了低氧條件下的自噬,并且抑制了細胞的增殖,促進了細胞的凋亡。5.低氧條件下,Fip200si RNA下調(diào)了TGF-β通路,其可能與對細胞增殖及凋亡影響有關(guān)。結(jié)論:1.成功研制了攜帶核酸適配體的DNA三角板納米材料,能高效轉(zhuǎn)運Fip200si RNA向PASMCs,并實現(xiàn)Fip200的抑制。2.低氧條件下PASMCs的高增殖、低凋亡的異常狀態(tài),于高自噬存在關(guān)系,抑制Fip200的表達,能逆轉(zhuǎn)這一過程。3.Fip200調(diào)控PASMCs的增殖、凋亡,可能與其下調(diào)TGF-β通路有關(guān),但仍需進一步驗證。
【圖文】：

載體結(jié)構(gòu)設(shè)計簡單，僅由四條核酸鏈構(gòu)成，易于合成。另外，為便于對照，合成攜帶無義序列NC siRNA的陰性對照組納米載體，其中1A鏈不變，2A鏈與NCsiRNA堿基互補配對。（圖2-1）

圖 2-2 攜帶 Fip200siRNA 的納米載體的凝膠電泳檢測不同濃度的 siFip200-DYM 納米材料在 PASMCs 細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)染效胞術(shù)檢測攜帶 Fip200siRNA-Cy3 的 TNP-aptamer 在不同濃度轉(zhuǎn)ip200-DYM 中 siFip200 的濃度依次為 0 nM、25 nM、50 nM、10 作為對照組，轉(zhuǎn)染 12h 之后應(yīng)用流式細胞儀檢測各組轉(zhuǎn)染效率米載體系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染濃度的增加，其轉(zhuǎn)染效率逐漸增加（P<0.0YM (siFip200：25nM)組轉(zhuǎn)染效率明顯的高于單獨的 Fip20組，提示納米材料可以明顯提高 siRNA 的轉(zhuǎn)染效率，并且具有。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R544.1

【參考文獻】

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1 胡煜;李剛;賈鵬;孫玉琴;付杰;盧翠俠;劉斌;;ERK1/2和PI3K/PKB信號通路在調(diào)節(jié)大鼠肺動脈平滑肌細胞外基質(zhì)基因表達中的作用[J];臨床兒科雜志;2013年12期

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本文編號：2534292