發(fā)布時間：2019-08-29 13:23

【摘要】：背景：缺血再灌注(IR)損傷在冠狀動脈疾病和心臟移植的發(fā)展中起著重要作用,可以引起心肌細(xì)胞凋亡,而凋亡性細(xì)胞死亡在IR損傷中扮演了關(guān)鍵的角色。分子量為38kD的促分裂素原活化蛋白激酶(p38)和核內(nèi)原癌基因c-Jun氨基末端激酶1/2(JNK1/2)的信號通路可以促進(jìn)心臟缺血再灌注所誘發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡,這些信號通路是通過刺激G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)而被激活的。G蛋白信號調(diào)節(jié)因子5(RGS5)是一種G蛋白介導(dǎo)信號的負(fù)性調(diào)節(jié)因子,在鼠科動物和人類成年心臟不同細(xì)胞里高度表達(dá),在胚胎發(fā)育、傷口愈合和生殖周期維護(hù)過程中發(fā)揮作用,并參與血管生成、血管外膜細(xì)胞成熟和心肌復(fù)極化,這與高血壓、動脈粥樣硬化、心律失常和心力衰竭的發(fā)病機(jī)理有關(guān)。然而RGS5在心臟缺血再灌注所誘發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡中所起的作用還不清楚。第一部分RGS5對在體小鼠心臟缺血再灌注期間心肌細(xì)胞凋亡的影響目的：探索RGS5對在體小鼠心臟缺血再灌注期間心肌細(xì)胞凋亡的影響方法：通過制備在體心臟I/R(30分鐘/24小時)模型,應(yīng)用血流動力學(xué)、TUNEL、免疫組化染色、RT-PCR和免疫印跡檢測,研究心臟特異性RGS5轉(zhuǎn)基因小鼠(TG)、RGS5基因敲除型小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)的心肌細(xì)胞凋亡和心功能變化。結(jié)果：研究表明,與WT組或KO組小鼠相比,在心臟IR期間TG組小鼠可顯著地抑制心肌細(xì)胞凋亡,證據(jù)是TUNEL染色水平較低、Bax表達(dá)水平降低,而Bcl-2表達(dá)水平升高；此外,與WT組或KO組小鼠相比,在心臟IR期間TG組小鼠的心臟功能異常顯著減輕,證據(jù)是血流動力學(xué)參數(shù)如+LVdp/dtmax、-LVdp/dtmax、LVESP和△LVP更顯著增加,而LVEDP明顯減少。結(jié)論：本研究證實RGS5可以抑制在體心臟IR期間的心肌細(xì)胞凋亡。第二部分RGS5對離體小鼠心臟缺血再灌注期間心肌細(xì)胞凋亡的影響目的：探索RGS5對離體小鼠心臟缺血再灌注期間心肌細(xì)胞凋亡的影響方法：一種Langendorff灌注I/R(15分鐘/30分鐘)模型應(yīng)用于心臟特異性RGS5轉(zhuǎn)基因小鼠(TG)、RGS5基因敲除型小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)的離體心臟,應(yīng)用血流動力學(xué)、透射電鏡、TUNEL、免疫組化染色、RT-PCR和免疫印跡檢測,研究心肌細(xì)胞凋亡和心功能變化。結(jié)果：研究結(jié)果表明,與WT組或KO組小鼠相比,TG組小鼠顯示心臟功能異常的改善,比如+LVdp/dtmax、-LVdp/dtmax、LVESP和△LVP等血流動力學(xué)指標(biāo)水平上升,而LVEDP明顯下降。我們還發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注期間,通過透射電子顯微鏡(TEM)、TUNEL、免疫組織化學(xué)(IHC)和RT-PCR分析,與WT組或KO組小鼠相比,TG組小鼠心肌細(xì)胞凋亡受得抑制,表現(xiàn)為核萎縮或染色質(zhì)凝聚明顯減少,TUNEL和促凋亡標(biāo)記物如Bax的陽性表達(dá)明顯減少,而抗凋亡標(biāo)記物如Bcl-2的表達(dá)明顯增加。結(jié)論：這些研究表明,在心肌缺血再灌注期間,RGS5可以抑制離體心臟IR期間的心肌細(xì)胞凋亡。第三部分抑制p38和JNK1/2信號通路對RGS5基因敲除小鼠心臟缺血再灌注期間心肌細(xì)胞凋亡的影響目的：探索抑制p38和JNK1/2信號通路對RGS5基因敲除小鼠心臟缺血再灌注期間心肌細(xì)胞凋亡的影響。方法：一種Langendorff灌注IR(15分鐘/30分鐘)模型應(yīng)用于野生型小鼠(WT)、人類RGS5表達(dá)心臟特異性轉(zhuǎn)基因小鼠(TG)和RGS5敲除型小鼠(KO)的心臟,觀察p38和JNKl/2蛋白的表達(dá)情況,以及通過抑制p38和JNK1/2信號通路應(yīng)用血流動力學(xué)、透射電鏡、TUNEL、免疫組化染色、RT-PCR和免疫印跡檢測,觀察RGS5基因敲除小鼠心臟缺血再灌注期間心肌細(xì)胞凋亡和心功能的變化。結(jié)果：我們發(fā)現(xiàn),在IR組與WT或KO心肌相比,TG心肌的p38和JNK1/2磷酸化程度減少。而在IR組與WT心肌相比,KO心肌顯示JNK1/2和p38磷酸化的增加。在IR期間RGS5-KO、鼠心肌與給予生理鹽水(NS)處理組相比,在給予SB203580(一種p38抑制劑)+SP600125(一種JNK1/2抑制劑)處理組的電鏡觀察核萎縮或染色質(zhì)凝聚程度明顯減低,TUNEL染色陽性細(xì)胞和促凋亡標(biāo)記物如Bax的表達(dá)明顯減少,但抗凋亡標(biāo)記物如Bcl-2表達(dá)的程度明顯增強(qiáng)。此外,在心臟IR期間,RGS5-KO小鼠心臟與NS處理組相比,SB203580+SP600125處理組的血流動力學(xué)指標(biāo)如+LVdp/dtmax、-LVdp/dtmax、LVESP和ALVP顯著提高,而LVEDP明顯減少。結(jié)論：這些研究表明,在心肌缺血再灌注期間,RGS5可以通過抑制p38和JNK1/2信號通路來減少心肌細(xì)胞凋亡。這些發(fā)現(xiàn)通過靶向RGS5相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能為治療心肌缺血再灌注誘發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡提供了改進(jìn)方案。
【圖文】：

異調(diào)１邋Ａ－Ｅ）。此外，與化后ＷＴ小鼠相比，，ＴＧ小鼠的屯、臟功能異常顯著減輕，逡逑證據(jù)是血流動力學(xué)參數(shù)如＋ＬＶｄｐ／血ｍａｘ、－ＬＶｄｐ／ｄｔｍａｘ、ＬＶＥＳＰ和么ＬＶＰ更顯著增逡逑加，而ＬＶＥＤＰ明思減少（圖２）。為了進(jìn)一步研究ＲＧＳ５過表達(dá)對化后也肌細(xì)胞逡逑調(diào)ｔ的影響，我們比較屯、肌化處理對ＴＧ和Ｋ０小鼠的影響。我們發(fā)現(xiàn)與ＫＯ逡逑小鼠屯、臟相比，ＴＧ小鼠屯、肌顯示化誘發(fā)屯、肌細(xì)胞調(diào)亡的抑制，證據(jù)是顯示逡逑ＴＵＮＥＬ、Ｃａｓｐａｓｅ邋３和Ｂａｘ陽性屯、肌細(xì)胞明顯減少，Ｂｄ－２陽性細(xì)胞增加。在對逡逑照組沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異（圖１邋Ａ－巧。此外，與ＩＲ后ＫＯ小鼠也臟相比，ＴＧ小鼠逡逑也臟的血流動力學(xué)參數(shù)如＋ＬＶｄｐ／血ｍａｘ、－ＬＶｄｐ／ｄｔｍａｘ、ＬＶＥＳＰ和ＡＬＶＰ明顯增加，逡逑但相比之下ＬＶＥＤＰ明顯減少（圖２）。然而，在對照組ＴＧ和ＫＯ小鼠之間沒有發(fā)逡逑現(xiàn)明顯差異。逡逑為了進(jìn)一步確定ＲＧＳ５－ＫＯ對也肌細(xì)胞調(diào)亡的影響，我們比較屯、臟ＩＲ期間逡逑的ＫＯ小鼠與ＷＴ小鼠。我們發(fā)現(xiàn)與ＷＴ小鼠相比

ＲＧＳ５對化期間也肌細(xì)胞調(diào)亡的影響逡逑屯、臟組織ＲＧＳ５免疫印跡實驗表明Ｋ０小鼠的ＲＧＳ５基因被成功敲除，ＴＧ逡逑小鼠的ＲＧＳ５基因被過度表達(dá)（圖３）。逡逑為了確定在屯、臟化期間過表達(dá)ＲＧＳ５是否抑制細(xì)胞調(diào)ｔ，ＴＧ小鼠和同窩出逡逑生ＷＴ小鼠用于屯、臟化。我們的結(jié)果顯示，與ＷＴ小鼠相比在屯、臟化期間，ＴＧ逡逑小鼠可顯著地抑制也肌細(xì)胞調(diào)亡，證據(jù)是ＴＵＮＥＬ染色水平較低、Ｃａｓｐａｓｅ邋３和逡逑Ｂａｘ表達(dá)水平降低，而Ｂｃｌ－２表達(dá)水平升高；然而，在對照組沒有發(fā)現(xiàn)明顯的差逡逑異調(diào)１邋Ａ－Ｅ）。此外，與化后ＷＴ小鼠相比，ＴＧ小鼠的屯、臟功能異常顯著減輕，逡逑證據(jù)是血流動力學(xué)參數(shù)如＋ＬＶｄｐ／血ｍａｘ、－ＬＶｄｐ／ｄｔｍａｘ、ＬＶＥＳＰ和么ＬＶＰ更顯著增逡逑加，而ＬＶＥＤＰ明思減少（圖２）。為了進(jìn)一步研究ＲＧＳ５過表達(dá)對化后也肌細(xì)胞逡逑調(diào)ｔ的影響，我們比較屯、肌化處理對ＴＧ和Ｋ０小鼠的影響。我們發(fā)現(xiàn)與ＫＯ逡逑小鼠屯、臟相比
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R541

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本文編號：2530545