【摘要】：缺血性心肌病(IHD)是指由于冠狀動(dòng)脈狹窄閉塞,以及心肌慢性缺血引起的心肌供血、供氧障礙,導(dǎo)致心肌收縮舒張功能受損以及心肌梗死。由于心肌的高耗能特性,IHD也可稱為“代謝疾病”。在心肌梗死過程中,心臟需要快速適應(yīng)缺氧/缺血狀態(tài),經(jīng)歷從有氧代謝到無氧代謝的巨大轉(zhuǎn)變。缺血狀態(tài)下心肌能量代謝的適應(yīng)性改變對(duì)缺血心肌的能量維持和抗缺血能力至關(guān)重要。因此,闡明心肌缺血過程中調(diào)控能量代謝的關(guān)鍵因子并探尋相應(yīng)的IHD防治策略是亟待解決的重要問題。丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(Pyruvate dehydrogenase complex,PDHc)是線粒體基質(zhì)內(nèi)的多酶復(fù)合物,由三種酶(E1:丙酮酸脫氫酶,E2:二氫硫辛酰轉(zhuǎn)乙�；�,E3:二氫硫辛酸脫氫酶)組成。該酶復(fù)合物是催化丙酮酸氧化脫羧成乙酰輔酶A的關(guān)鍵酶。PDHc所催化的反應(yīng)過程連接了糖酵解,檸檬酸循環(huán)以及ATP形成。已有證據(jù)顯示,心肌PDHc活性對(duì)于不同病理?xiàng)l件下心肌能量應(yīng)答發(fā)揮重要作用。但是,正因?yàn)镻DH對(duì)細(xì)胞能量代謝的重要作用,單純敲除PDH造成動(dòng)物致死性,以往對(duì)心肌PDH的生物學(xué)作用研究缺乏良好的動(dòng)物模型。此外,在心肌缺血狀態(tài)下,PDH多酶復(fù)合物中三種酶的心肌特異性作用和相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制也缺乏深入的探討。AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是細(xì)胞內(nèi)最重要的應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)酶之一,其激活和失活主要受細(xì)胞內(nèi)能量水平調(diào)節(jié)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)能量需求增加或供應(yīng)減少而導(dǎo)致AMP與ATP比例失調(diào)時(shí),AMPK激活可使ATP合成系統(tǒng)活性增強(qiáng)同時(shí)使ATP消耗減少。我們前期工作證實(shí),缺血心肌中AMPK激活可調(diào)控心肌的能量底物代謝,通過影響葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)GLUT4的膜轉(zhuǎn)位增加缺血心肌對(duì)葡萄糖的利用。并且,我們前期工作還發(fā)現(xiàn),缺血心肌AMPK的磷酸化激活依賴于其上游激酶LKB1與Sestrin2蛋白形成激活復(fù)合物。同為重要的能量代謝調(diào)控因子,PDH對(duì)心肌AMPK是否存在調(diào)控作用?在心肌缺血狀態(tài)下PDH與AMPK的激活存在何種相互作用?都尚待闡明。因此,本研究構(gòu)建了誘導(dǎo)型心肌特異性PDH E1α敲除小鼠(inducible cardiac-specific PDH E1αknockout,PDH E1αi CKO),探討了心肌特異性PDH E1α缺失對(duì)心肌缺血損傷的影響,并分析相關(guān)信號(hào)機(jī)制。目的:(1)明確PDH活性對(duì)心肌缺血損傷的影響;(2)明確心肌缺血狀態(tài)下,PDH對(duì)心肌葡萄糖代謝的調(diào)節(jié)作用,(3)探討PDH上述生物學(xué)作用是否與AMPK有關(guān)并分析PDH與AMPK相互作用的分子機(jī)制。方法:構(gòu)建PDH E1αi CKO小鼠,以Cre小鼠為對(duì)照,建立在體心肌缺血模型,分別于缺血后不同時(shí)間點(diǎn)收集心肌組織檢測(cè)相關(guān)信號(hào)表達(dá),心臟收縮舒張功能和形態(tài)學(xué)觀察。采用Working-Heart灌流系統(tǒng)檢測(cè)心肌葡萄糖及脂肪酸代謝,糖酵解及葡萄糖攝取。結(jié)果:(1)通過他莫昔芬可誘導(dǎo)的心肌特異α-MHC啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Cre轉(zhuǎn)基因小鼠(α-MHC-Cre ERT2)作為介導(dǎo)敲除的工具鼠,將其與PDH E1α條件基因小鼠(PDH E1αflox/flox)結(jié)合獲得α-MHC-Cre ERT2陽(yáng)性的Flox/Flox鼠III(Cre ERT2-PDH flox/flox),采用PCR方法鑒定小鼠的基因型。Cre ERT2-PDHflox/flox小鼠注射他莫昔芬(0.08 mg/g,i.p.5 days)在體誘導(dǎo)心肌PDH E1α基因敲除。經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性;提取各器官組織經(jīng)Western-Blot檢測(cè)證實(shí)成功構(gòu)建在體可誘導(dǎo)心肌特異性PDH E1α敲除小鼠(PDH E1αi CKO)。(2)與單純Cre ERT2對(duì)照小鼠相比,PDH E1αi CKO小鼠隨年齡增加逐步出現(xiàn)心肌肥大表型。至4月齡,PDH E1αi CKO小鼠心重/體重比顯著增加;TRITC-麥胚凝集素染色證實(shí)PDH E1αi CKO小鼠心肌細(xì)胞顯著肥大;Mac-2免疫組化染色,Masson染色以及檢測(cè)金屬蛋白酶-9(MMP-9)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)m RNA結(jié)果提示,PDH E1αi CKO小鼠心肌存在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及心肌纖維化。并且,與Cre ERT2對(duì)照小鼠相比,PDH E1αi CKO小鼠死亡率增加,生存周期顯著縮短。(3)與心肌纖維化結(jié)果相一致,采用心臟超聲檢查證實(shí):PDH E1α敲除導(dǎo)致心臟收縮舒張功能減退,左室舒張期間內(nèi)徑(LVID d)和射血分?jǐn)?shù)(EF%),較Cre ERT2對(duì)照小鼠顯著降低。并且發(fā)現(xiàn),PDH E1α敲除顯著降低了小鼠心肌基礎(chǔ)代謝中葡萄糖氧化率。上述結(jié)果證實(shí)PDH在維持心肌功能和代謝中的重要作用。(4)為明確心肌特異性PDH E1α敲除的生物學(xué)后果,對(duì)PDH E1αi CKO小鼠及對(duì)照小鼠建立在體心肌缺血模型。結(jié)果顯示,PDH E1α敲除顯著加重心肌缺血損傷程度,心肌梗死面積顯著增大。采用PDH特異性激動(dòng)劑二氯乙酸(DCA)可有效增加對(duì)照小鼠心肌PDH活性,有效減輕心肌缺血損傷程度。上述DCA的心肌保護(hù)作用在PDH E1αi CKO被完全阻斷。(5)進(jìn)一步證實(shí),采用DCA激活心肌PDH,可有效增加心肌缺血過程中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT4)的膜轉(zhuǎn)位,促進(jìn)缺血心肌的葡萄糖攝取。并且發(fā)現(xiàn),DCA激活心肌PDH可有效優(yōu)化缺血心肌的能量底物代謝,增加對(duì)葡萄糖的利用而抑制脂肪酸氧化。(6)更為重要的是,我們的結(jié)果顯示,采用PDH特異性激動(dòng)劑DCA處理可有效增強(qiáng)缺血心肌的AMPK磷酸化水平。反之,DCA對(duì)缺血心肌損傷及能量代謝的調(diào)控作用在AMPK KD小鼠均被抑制。該結(jié)果提示,心肌PDH的生物學(xué)作用可能由AMPK活性所介導(dǎo)。(7)通過Co-IP結(jié)果首次發(fā)現(xiàn),心肌PDH與AMPK存在直接調(diào)控關(guān)系。我們首次通過整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),心肌特異性PDH E1α敲除后,殘余的PDH E2/3亞基復(fù)合物與心肌Sestrin2的相互作用顯著增強(qiáng),轉(zhuǎn)而削弱了Sestrin2-LKB1復(fù)合物的形成,導(dǎo)致PDH E1αi CKO小鼠心肌在缺血過程中AMPK活性被抑制。結(jié)論:本研究首次采用誘導(dǎo)型心肌特異性PDH E1α敲除小鼠證實(shí)PDH是維持心肌心肌能量代謝以及收縮舒張功能的關(guān)鍵因子,激活PDH可以有效調(diào)整缺血心肌的底物代謝。我們首次發(fā)現(xiàn),心肌PDH與AMPK存在直接調(diào)控關(guān)系,PDH缺失可導(dǎo)致AMPK失活并顯著加重心肌缺血損傷。
【圖文】：

圖 1.1 PDH 復(fù)合體活性調(diào)控機(jī)制（引自 Sun W et al. Life Sci 2015）丙酮酸脫氫酶復(fù)合體會(huì)受到三種方式調(diào)控：第一種稱為產(chǎn)物抑制，也就是復(fù)合物所催化生成的產(chǎn)物乙酰輔酶 A 與 NADH，能夠抑制復(fù)合物的作

及GLUT4膜轉(zhuǎn)運(yùn)。有趣的是，我們前期的初步數(shù)據(jù)還表明，AMPK促LUT4膜轉(zhuǎn)位的機(jī)制是由于TUG的解離所引起。心肌缺血所致的AMPK，可以促使TUG裂解（由60KDa裂解為42KDa）。缺血心肌中的上述變化及TUG的裂解現(xiàn)象，在AMPK KD小鼠中均消失。因此，，我們的前期初步證實(shí)，缺血心肌AMPK活化刺激TUG裂解，并導(dǎo)致在細(xì)胞內(nèi)囊UG和GLUT4之間的解離。TUG通過AMPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑，是調(diào)節(jié)心LUT4至細(xì)胞表面，并增強(qiáng)葡萄糖攝取的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。除了刺激GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)MPK也增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子肌細(xì)胞增強(qiáng)因子-2（MEF-2），以與啟動(dòng)子結(jié)合以加GLUT4基因表達(dá)[146]。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R54

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 孫韜;錢克平;沈樂平;Ian Philips;施海明;;單質(zhì)粒心肌特異性缺氧調(diào)節(jié)SDF-1警戒載體在小鼠心肌梗死治療中的應(yīng)用[J];中國(guó)分子心臟病學(xué)雜志;2013年03期

2 楊奕清;劉懿;董雄劍;林捷;陳義漢;;心肌特異性表達(dá)人KCNE4轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立[J];同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2006年06期

3 盧新政,黃峻,馬根山,侯麥花;5-氮胞苷對(duì)培養(yǎng)大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞β肌球蛋白重鏈表達(dá)的影響 骨髓干細(xì)胞移植與心肌修復(fù)的相關(guān)效應(yīng)[J];中國(guó)臨床康復(fù);2003年09期

4 郭茂娟;范英昌;徐秀梅;趙旭;;5-氮胞苷誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2007年46期

5 葉忠;張必利;徐榮良;趙仙先;秦永文;唐念中;鄭興;;斑馬魚心肌特異性啟動(dòng)子的克隆及其功能鑒定[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2012年27期

6 楊虹;鄧成國(guó);;IGF-1基因轉(zhuǎn)染促進(jìn)胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞中IGF-1、肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白及心肌特異性肌鈣蛋白-T的表達(dá)[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2009年02期

7 高偉聰;劉贊朝;;心肌特異性微小RNA研究進(jìn)展[J];生物醫(yī)學(xué)工程與臨床;2014年01期

8 錢波;劉莉;閔笑顏;張小進(jìn);程蘊(yùn)琳;;心肌特異性高表達(dá)熱休克蛋白27抑制阿霉素誘導(dǎo)的小鼠心肌凋亡[J];實(shí)用老年醫(yī)學(xué);2007年03期

9 郭軍,林國(guó)生,鮑翠玉,賈光宏,楊波,汪蕾,劉維新;干細(xì)胞因子對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與分化的影響[J];中國(guó)醫(yī)師雜志;2004年12期

10 馮艷,劉冬青,王震,曹慧青,時(shí)娜,鄧仲端,丁金鳳,孟憲敏;心肌特異性新蛋白激酶p93和peroxiredoxin3的相互作用[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2004年08期

相關(guān)會(huì)議論文 前1條

1 魯榮;朱靜;田杰;呂鐵偉;林建萍;鄧兵;劉建平;智深深;;Islet-1在C3H10T1/2細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化過程中對(duì)心肌特異性基因組蛋白乙酰化修飾的促進(jìn)作用[A];中國(guó)的遺傳學(xué)研究——遺傳學(xué)進(jìn)步推動(dòng)中國(guó)西部經(jīng)濟(jì)與社會(huì)發(fā)展——2011年中國(guó)遺傳學(xué)會(huì)大會(huì)論文摘要匯編[C];2011年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 孫晚晴;誘導(dǎo)型心肌特異性丙酮酸脫氫酶敲除對(duì)心肌缺血損傷的影響及其機(jī)制[D];吉林大學(xué);2016年

2 孫韜;單質(zhì)粒心肌特異性缺氧調(diào)節(jié)SDF-1警戒載體在小鼠心肌梗死治療中的應(yīng)用[D];復(fù)旦大學(xué);2010年

3 陳緒軍;人PGCs來源的EBD細(xì)胞向人心肌細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2004年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 顧明霞;心肌特異性高表達(dá)Hsp27對(duì)ISO誘導(dǎo)小鼠心肌肥厚的保護(hù)作用[D];南京醫(yī)科大學(xué);2006年

2 朱含章;MLC-2v心肌特異性核心啟動(dòng)子和RTP801核心缺氧反應(yīng)性增強(qiáng)子調(diào)控下VEGF_（165）和FGF_2的高效共表達(dá)[D];南京醫(yī)科大學(xué);2007年

本文編號(hào)：2525284