【摘要】：第一部分動(dòng)脈粥樣硬化患者外周血可溶性環(huán)氧化物水解酶表達(dá)水平研究背景近年來(lái),我國(guó)醫(yī)療水平雖然取得巨大進(jìn)步,但動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)和其相關(guān)并發(fā)癥仍然是威脅人類健康的主要原因之一。由于高脂飲食引起的動(dòng)脈粥樣硬化十分常見(jiàn)。動(dòng)脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病,系統(tǒng)性和/或局部的炎癥參與了從動(dòng)脈粥樣硬化起始到斑塊破裂的全過(guò)程。致動(dòng)脈粥樣硬化的眾多因素例如氧化應(yīng)激、晚期糖基化終產(chǎn)物、高血壓和吸煙等都可導(dǎo)致血管細(xì)胞自噬,從而加速脂質(zhì)的血管沉積、單核細(xì)胞向受損內(nèi)皮遷徙黏附并進(jìn)入內(nèi)膜下轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞還可分泌多種蛋白降解酶類如膠原酶和細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶等,降解纖維帽中膠原成分,導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定甚至破裂,最終產(chǎn)生嚴(yán)重的臨床后果如心肌梗死和腦梗塞等。在人體多種蛋白降解酶中,環(huán)氧化物水解酶可能在調(diào)控粥樣硬化斑塊中發(fā)揮作用。環(huán)氧化物水解酶廣泛分布于動(dòng)物界(包括人類),在肝臟中,環(huán)氧化物水解酶主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,最近的研究表明,它也分布于肝細(xì)胞的核膜、胞漿中,而在環(huán)氧化物酶體、溶酶體和線粒體中缺失。環(huán)氧化物水解酶以多種同工酶形式存在,酶的單體相對(duì)分子量為48k-54k之間,沒(méi)有血紅蛋白和黃素做輔基。環(huán)氧化物水解酶也可催化內(nèi)源性和外源性的環(huán)氧化物,其中對(duì)內(nèi)源性環(huán)氧化物的速率遠(yuǎn)大于外源性的環(huán)氧化物。因?yàn)榄h(huán)氧化物水解酶在致癌物的形成中扮演一定角色,所以被作為肝癌的早期標(biāo)志而受到廣泛關(guān)注�？扇苄原h(huán)氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase,s EH)在調(diào)控機(jī)體環(huán)氧化物代謝中發(fā)揮重要作用,其主要功能是降解環(huán)氧花生四烯酸(epoxyeicosatrienoic acids,EETs),并使其生物活性降低。通常情況下,EETs是由花生四烯酸(arachidonic acid,AA)經(jīng)過(guò)肝臟中大量存在的細(xì)胞色素P450代謝而形成的代謝產(chǎn)物。EETs的生物學(xué)功能較為復(fù)雜,在腫瘤中可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞的遷徙和轉(zhuǎn)移,在心血管疾病中,EETs則可以抑制炎癥過(guò)程及血小板聚集,降低動(dòng)脈粥樣硬化脂質(zhì)斑塊形成及破裂,促進(jìn)粥樣硬化梗死區(qū)血管生成等多種生物活性,因此,近年研究也將s EH及s EH抑制劑作為粥樣硬化、冠心病(Coronary Heart Disease,CHD)及高脂血癥等疾病的主要治療靶點(diǎn)。在本研究中,我們進(jìn)一步探討s EH在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的重要作用,以期為s EH作為動(dòng)脈粥樣硬化的治療靶點(diǎn)提供豐富的理論依據(jù)。目的在我國(guó)動(dòng)脈粥樣硬化患者中進(jìn)行可溶性環(huán)氧化物水解酶檢測(cè),探討動(dòng)脈粥樣硬化患者血脂水平,冠心病患者超聲心動(dòng)指標(biāo)與外周血可溶性環(huán)氧化物水解酶水平相關(guān)性。方法(1)根據(jù)動(dòng)脈粥樣硬化臨床診斷標(biāo)準(zhǔn),在就診于我院門(mén)診及住院的患者中篩選AS患者,冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者,并隨機(jī)篩選同期就診于我院健康體檢中心年齡、性別比例匹配的健康對(duì)照者;(2)查閱文獻(xiàn)并進(jìn)行調(diào)查問(wèn)卷設(shè)計(jì),收集患者各項(xiàng)生化檢查及超聲心動(dòng)檢查指標(biāo),簽署知情同意書(shū);(3)采集外周靜脈血,4℃離心取上層血清樣品檢測(cè)入組患者及健康對(duì)照者中外周血s EH水平,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;(4)使用Spearman相關(guān)分析進(jìn)一步分析患者s EH水平與血清學(xué)指標(biāo)以及超聲心動(dòng)指標(biāo)之間的相關(guān)性。結(jié)果(1)自2014年1月至2015年6月,參考AHA關(guān)于動(dòng)脈粥樣硬化診斷標(biāo)準(zhǔn),篩選就診于我院動(dòng)脈硬化門(mén)診的粥樣硬化病人214例,冠心病病人138例,并篩選同期就診于我院健康體檢中心,且年齡性別比例匹配的健康成人182例;(2)各組患者年齡、性別匹配,對(duì)此進(jìn)行均衡性檢驗(yàn),結(jié)果顯示年齡組(P=0.2310.05),性別組(P=0.8440.05)兩組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,年齡、性別均衡,組間具有可比性;(3)我們對(duì)入組患者及健康對(duì)照進(jìn)行組間相關(guān)性的顯著性檢驗(yàn),判斷與疾病密切相關(guān)的病因因素。由于變量較多,首先采用單因素分析,發(fā)現(xiàn)在我們關(guān)注的16項(xiàng)可疑因素中,有6項(xiàng)是與研究疾病有關(guān)聯(lián)的。由于血糖值無(wú)法用兩項(xiàng)分類,因此我們對(duì)上述指標(biāo)采用定量分析方法。受教育程度和職業(yè)屬于等級(jí)分類指標(biāo),采用了秩和檢驗(yàn)。由表1-5可知:吸煙(P0.001)、總膽固醇(P=0.0040.05)、甘油三酯(P=0.0210.05)、低密度脂蛋白(P0.001)、高血壓病(P0.001)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;(4)我們使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)三組患者外周血s EH表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與健康對(duì)照組(0.21±0.02)ng/ml相比,AS組(128.48±19.42)ng/ml及CHD組(131.21±18.52)ng/ml患者外周血s EH水平明顯增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=28.32,P=0.001),而AS組及CHD組患者比較,未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=1.87,T=0.33);(5)對(duì)三組患者超聲心動(dòng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn),CHD組患者EF為(45.4±4.6)%,明顯低于單純AS者(58.3±8.5)%及健康對(duì)照(60.9±4.2)%,而CHD患者(58.7±3.5)mm及AS組(58.2±2.8)mm左心室舒張末期徑(LVEDD)明顯高于及健康對(duì)照者(52.3±5.3)mm,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);(6)進(jìn)一步使用方差齊性檢驗(yàn)對(duì)血糖等數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。將數(shù)值輸入SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件中得出結(jié)果(見(jiàn)表1-8),結(jié)果發(fā)現(xiàn),日靜坐時(shí)間、空腹血糖均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,只有日體力活動(dòng)時(shí)間(P=0.0010.05)是AS相關(guān)因素。受教育程度非兩項(xiàng)分類,而是用等級(jí)分類,對(duì)此采用秩和檢驗(yàn),見(jiàn)表1-9結(jié)果顯示:Z=1.8391.96,P=0.0680.05差別無(wú)顯著性,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明受教育程度并不是AS相關(guān)因素;(7)進(jìn)一步對(duì)職業(yè)性質(zhì)進(jìn)行秩和檢驗(yàn),結(jié)果表明,P0.001,說(shuō)明兩組間差別具有顯著性,職業(yè)是AS相關(guān)因素之一;(8)經(jīng)顯著性檢驗(yàn)后,確認(rèn)6項(xiàng)為AS的相關(guān)危險(xiǎn)因素。為進(jìn)一步探討相關(guān)因素與AS相關(guān)性,矯正混雜因素。將多種變量納入多因素分析,最終導(dǎo)入非條件Logistic回歸模型。采用后退法再逐個(gè)進(jìn)行篩選,選入變量的概率標(biāo)準(zhǔn)為0.05,剔除標(biāo)準(zhǔn)為0.05。結(jié)果表明,吸煙、高血壓、職業(yè)、低密度脂蛋白、總膽固醇具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);(9)以s EH為自變量,其余相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素為因變量,使用Spearman相關(guān)分析對(duì)上述數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果表明,s EH與高密度脂蛋白呈負(fù)相關(guān),rs=-1.18,y=-1.18x-12.381,而與低密度脂蛋白水平呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)rs=0.24,y=0.24x+1.398,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);(10)對(duì)入組患者外周血s EH與超聲心動(dòng)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行Spearman相關(guān)性發(fā)現(xiàn),在CHD患者中,外周血s EH水平與射血分?jǐn)?shù)EF呈負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)rs=-0.12,y(EF)=-0.12x+9.343而與左心室舒張末徑LVEDD呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)rs=0.16,y(LVEDD)=0.16x-2.587,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。我們認(rèn)為,監(jiān)測(cè)外周血s EH水平對(duì)于評(píng)估患者心臟重塑具有很好的提示作用。結(jié)論(1)吸煙、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高血壓病及日體力活動(dòng)時(shí)間都是AS發(fā)生的高危因素,在臨床治療及預(yù)防AS過(guò)程中應(yīng)當(dāng)在藥物治療的同時(shí),改善患者危險(xiǎn)因素暴露程度。(2)s EH在AS及CHD患者中表達(dá)水平增高,與血清低密度脂蛋白膽固醇水平呈正相關(guān)而與血清高密度脂蛋白膽固醇水平呈負(fù)相關(guān),此外,在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者中,其表達(dá)水平與射血分?jǐn)?shù)EF值呈負(fù)相關(guān),而與左心室舒張末徑呈正相關(guān),可以在臨床提示動(dòng)脈粥樣硬化心臟病心臟重塑的發(fā)生。第二部分可溶性環(huán)氧化物水解酶對(duì)細(xì)胞膽固醇代謝的研究背景在人體中,編碼可溶性環(huán)氧化物水解酶的基因?yàn)镋PHX2,其位于人類第8號(hào)染色體,可以編碼555個(gè)氨基酸。在生物化學(xué)結(jié)構(gòu)上,該基因編碼蛋白質(zhì)具有N端磷酸酶結(jié)構(gòu)域及C端可溶性環(huán)氧化物水解酶結(jié)構(gòu)域兩個(gè)主要的化學(xué)結(jié)構(gòu),這兩個(gè)結(jié)構(gòu)以二聚體形式相結(jié)合并穩(wěn)定存在。其中,N末端通常具有磷酸酶活性,正常情況下,可通過(guò)去磷酸化異戊烯焦磷酸途徑,調(diào)節(jié)血清膽固醇水平及細(xì)胞信號(hào)傳遞過(guò)程;其C末端是可溶性環(huán)氧化物水解酶結(jié)構(gòu)域,這一部分可催化體內(nèi)脂質(zhì)信號(hào)分子花生四烯酸環(huán)氧化合物類,通過(guò)結(jié)合一個(gè)水分子,形成二醇結(jié)構(gòu)進(jìn)行降解及破壞,從而使調(diào)控血清內(nèi)ETTs水平。在某些特殊情況下,如炎癥,外界環(huán)境變化或遺傳因素作用下,使得EPHX2表達(dá)水平異常增加,大量轉(zhuǎn)錄形成可溶性環(huán)氧化物水解酶后,體內(nèi)相對(duì)平衡的ETTs水平則受到破壞,而ETTs在人體多種組織器官中都可以發(fā)揮調(diào)控作用,如調(diào)節(jié)血管收縮舒張,調(diào)節(jié)腎臟血流量,調(diào)節(jié)腎小管濾過(guò)和重吸收作用等。血管穩(wěn)態(tài)由內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移共同影響和調(diào)控,而s EH似乎在這些生物學(xué)過(guò)程中起著重要的作用。EETs可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管生成,其環(huán)氧化物具有促進(jìn)小鼠和人類細(xì)胞的增殖的作用,EETs或CYP2C氧化酶的過(guò)度表達(dá)可以引發(fā)細(xì)胞增殖,這一過(guò)程可能與兩種細(xì)胞信號(hào)通路的激活有關(guān);p38絲裂原蛋白激酶(MAPK)通路和PI3K-AKT信號(hào)(PI3K/Akt)通路。11,12-EET激活MAPK,并上調(diào)cyclin D和Akt,磷酸化FOXO因子,并降低內(nèi)皮中細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p27kip1蛋白的活性。最近研究報(bào)道,11,12-EET介導(dǎo)的細(xì)胞增殖,遷移和成管作用在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)實(shí)驗(yàn)中被證明可以激活鞘氨醇激酶1(SK1)促進(jìn)磷酸鞘氨醇合成S1P。另一方面,可以作用于血管平滑肌細(xì)胞,發(fā)揮抗遷移作用。11,12-EET與14,15-EET可以輕度抑制主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞遷移,作為對(duì)血小板衍生生長(zhǎng)因子和CYP2J表氧化酶過(guò)表達(dá)或s EH抑制的反應(yīng),可以減少平滑肌細(xì)胞增殖和遷移。激活c AMP依賴的PKA信號(hào)通路及cyclin D水平,降低EETs活化及s EHIs的血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力。盡管上述研究結(jié)果表明,s EHIs對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的遷移具有一定影響,但也有研究報(bào)道,s EHIs影響或?qū)е卵芷交〖?xì)胞增殖的作用尚不明確。更重要的是,在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)皮下海綿模型中,EETs可以刺激并引發(fā)血管新生,而抑制s EH則可以通過(guò)增強(qiáng)促血管新生和新生血管化反應(yīng)促進(jìn)血管新生。EETs和s EHIs在內(nèi)皮及血管平滑肌細(xì)胞增殖及遷移中的作用表明,這一通路在血管新生,動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病中發(fā)揮重要作用,并有望作為潛在的藥物治療靶點(diǎn)。由此可見(jiàn),EETs在心血管領(lǐng)域具有重要的作用,因此,在心血管病人中,有針對(duì)性地保護(hù)體內(nèi)EETs水平,降低外周血可溶性環(huán)氧化物水解酶水平可能發(fā)揮一定的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。在上一部分研究中,我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn),在動(dòng)脈粥樣硬化及冠心病患者中,外周血可溶性環(huán)氧化物水解酶水平可明顯增高,且與患者外周低密度脂蛋白膽固醇呈現(xiàn)正相關(guān),而與高密度脂蛋白呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)現(xiàn)象。但是,編碼可溶性環(huán)氧化物水解酶的基因EPHX2在脂質(zhì)代謝以及維持細(xì)胞內(nèi)LDL與HDL平衡等生物學(xué)作用尚不明確。由于EPHX2在脂質(zhì)代謝中的特殊作用,如使用si RNA將細(xì)胞內(nèi)EPHX2基因完全敲除有礙于細(xì)胞的正常生長(zhǎng),在在體研究中,EPHX2基因敲除后,由于膽固醇及脂質(zhì)代謝出現(xiàn)異常,基因敲除鼠的存活時(shí)間通常較短。這也成為目前體外研究中的瓶頸。但也提示我們,是否可以通過(guò)基因編輯的方法,設(shè)計(jì)某位點(diǎn)突變的EPHX2載體,既可以保證細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的正常生長(zhǎng),又可以對(duì)探討和深入研究EPHX2基因功能可能發(fā)揮一定優(yōu)勢(shì)。目的構(gòu)建野生型及突變型質(zhì)粒,進(jìn)一步探討編碼可溶性環(huán)氧化物水解酶基因EPHX2對(duì)細(xì)胞膽固醇代謝的作用。方法(1)據(jù)野生型質(zhì)粒WT,構(gòu)建突變型質(zhì)粒并一代測(cè)序驗(yàn)證,體外轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞系;(2)收集轉(zhuǎn)染后的WT細(xì)胞及轉(zhuǎn)染突變質(zhì)粒的細(xì)胞,使用免疫印跡法檢測(cè)EPHX2蛋白表達(dá)水平,進(jìn)一步檢測(cè)PKA信號(hào)通路活化情況;(3)使用可溶性環(huán)氧化物水解酶活性試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中EPHX2的酶活性水平;連續(xù)培養(yǎng)48h后,使用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)293T細(xì)胞的細(xì)胞活力;(4)采用流式分析儀檢測(cè)EPHX2對(duì)LDLR內(nèi)吞LDL功能的影響;并檢測(cè)293T細(xì)胞細(xì)胞周期并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;(5)采用流式分析儀檢測(cè)EPHX2對(duì)LDLR結(jié)合LDL功能的影響;(6)使用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)293T細(xì)胞的侵襲能力;使用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力;(7)Western Blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞PKA表達(dá)水平并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果(1)以野生型EPHX2載體質(zhì)粒為模板,對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增,產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)搖菌擴(kuò)增提取質(zhì)粒,最終測(cè)序證實(shí):所挑克隆為目的基因克隆。(2)可溶性環(huán)氧化物水解酶分子量約為62KDa,而GFP標(biāo)簽蛋白分子量約28KDa,因此EPHX2-GFP融合蛋白分子量約90KDa左右,在調(diào)整GAPDH一致情況下,正常組即不做任何處理的細(xì)胞因無(wú)GFP標(biāo)簽,因此當(dāng)用GFP標(biāo)簽抗體檢測(cè)時(shí)沒(méi)有觀察到EPHX2-GFP融合蛋白的存在,而野生型及突變型質(zhì)粒因便于觀察帶有GFP標(biāo)簽,故在90KDa左右處觀察到融合蛋白的存在。(3)以正常細(xì)胞EPHX2的酶活性作為細(xì)胞中的本底酶活性。通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染野生型及突變型EPHX2質(zhì)粒,過(guò)表達(dá)EPHX2蛋白,可以檢測(cè)到轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒及突變型EPHX2,細(xì)胞的總體酶活性明顯較未轉(zhuǎn)染組高,轉(zhuǎn)染突變型EPHX2組可溶性環(huán)氧化物水解酶活性較野生型組顯著降低(P0.01)。(4)將正常細(xì)胞、轉(zhuǎn)染野生型及突變型質(zhì)粒的細(xì)胞鋪在六孔板內(nèi),1.5μg/ml Dil-LDL抗體于37℃孵育4小時(shí),流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞LDLR內(nèi)吞LDL的能力。結(jié)果表明EPHX2顯著影響LDLR內(nèi)吞LDL功能,其LDLR內(nèi)吞LDL能力相對(duì)野生型下降25.3%,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。(5)將細(xì)胞種在六孔板內(nèi),Dil-LDL抗體4℃孵育4小時(shí),流式檢測(cè)EPHX2對(duì)LDLR結(jié)合LDL能力的影響。結(jié)果表明EPHX2可顯著影響LDLR結(jié)合LDL的功能,LDLR結(jié)合LDL能力相對(duì)野生型下降19.5%,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。(6)將293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)入野生質(zhì)粒及突變質(zhì)粒后,在37℃,5%CO2條件的孵育箱中連續(xù)培養(yǎng)48h后,我們發(fā)現(xiàn),與WT組相比,突變組中293T細(xì)胞的增殖速率明顯高于干預(yù)對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力發(fā)現(xiàn),R287Q組細(xì)胞侵襲能力明顯高于WT組及CON組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),提示突變后293T細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)。(7)在轉(zhuǎn)入EPHX2野生型及突變型質(zhì)粒后,檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn),與WT組相比,R287Q組細(xì)胞S期細(xì)胞數(shù)量明顯小于WT組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(8)使用Transwell法檢測(cè)R287Q及WT,CON細(xì)胞遷徙能力發(fā)現(xiàn),與0h相比,三組細(xì)胞劃痕距離均明顯縮小,但R287Q組縮小程度明顯小于CON及WT組,說(shuō)明48h R287Q組細(xì)胞遷徙能力明顯增強(qiáng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(9)進(jìn)一步檢測(cè)三組細(xì)胞PKA信號(hào)通路表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),與WT組及CON組相比,R287Q組細(xì)胞PKA表達(dá)水平明顯減低,提示EPHX2基因可能通過(guò)PKA信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。結(jié)論EPHX2突變后可降低可溶性環(huán)氧化物水解酶的活性,降低細(xì)胞LDLR對(duì)LDL的內(nèi)吞和結(jié)合功能,通過(guò)PKA通路發(fā)揮這一生物學(xué)作用。
【圖文】：

（2）1.5%的瓊脂糖凝膠配置方法：基本配置方法和步驟同上，但是需要將瓊脂糖的質(zhì)量改為 1.5g。15 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析對(duì)于符合正態(tài)分布的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，通常采用獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)來(lái)表示兩組間均數(shù)的比較，而非正態(tài)分布數(shù)據(jù)則采用非參數(shù)檢驗(yàn)，應(yīng)用Graphpad prism 6.0 統(tǒng)計(jì)軟件，，以 P＜0.05 為有差異，P＜0.01 有顯著差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1 EPHX2 與 GFP 融合表達(dá)載體的構(gòu)建以野生型 EPHX2 載體質(zhì)粒為模板，對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)搖菌擴(kuò)增提取質(zhì)粒，最終測(cè)序證實(shí)：所挑克隆為目的基因克隆見(jiàn)圖 2-1。

圖 2-2 野生型及質(zhì)粒中 EPHX2 蛋白的表達(dá)型 EPHX2 活性檢測(cè)EPHX2 的酶活性作為細(xì)胞中的本底酶活性。通X2 質(zhì)粒，過(guò)表達(dá) EPHX2 蛋白，可以檢測(cè)到體酶活性明顯較未轉(zhuǎn)染組高，轉(zhuǎn)染突變型 EPHX野生型組顯著降低（**P<0.01）見(jiàn)圖 2-3。圖 2-3 EPHX2 活性檢測(cè)結(jié)果（mean+MEM，n=3）
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R543.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Hong-mei Gu;Da-wei Zhang;;Hypercholesterolemia,low density lipoprotein receptor and proprotein convertase subtilisin/kexin-type 9[J];The Journal of Biomedical Research;2015年05期

2 褚現(xiàn)明;李冰;安毅;董果雄;;炎癥與動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系研究進(jìn)展[J];中國(guó)分子心臟病學(xué)雜志;2010年03期

本文編號(hào)：2525256