【摘要】：背景高血壓已成為嚴(yán)重的世界公眾健康問(wèn)題,靶器官損害是高血壓最主要的死亡因素。其中,心肌纖維化(myocardial fibrosis, MF)的嚴(yán)重程度己成為決定高血壓心臟靶器官損害發(fā)展及預(yù)后的主要因素。因此進(jìn)一步明確高血壓心肌纖維化的機(jī)制并尋找更有效的治療和預(yù)防措施,具有深遠(yuǎn)的臨床意義和理論價(jià)值。目前治療高血壓MF的藥物主要包括：血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)、血管緊張素受體抑制劑(ARB)、醛固酮受體抑制劑、p受體阻滯劑、他汀類及天然藥物。隨著人們?cè)絹?lái)越關(guān)注化學(xué)藥品的副作用及局限性,如ACEI及ARB類藥物的鉀潴留使腎功能不全病人應(yīng)用需謹(jǐn)慎等,則對(duì)天然藥物的信賴與日俱增。天然藥物是指經(jīng)現(xiàn)代醫(yī)藥體系證明具有一定藥理活性的動(dòng)物藥、植物藥和礦物藥,具有獲得方便、廉價(jià)、副作用小等特點(diǎn)。近幾年天然藥物的研發(fā)迅速進(jìn)展,禁制趨于寬松。葡萄籽原花青素(grape seeds procyanidine extracts, GSPE)是葡萄籽所含的最主要的有效成分,具有抗氧化、清除自由基的作用。近年國(guó)內(nèi)外的研究還提出GSPE具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗腫瘤、抗衰老等作用。我們課題組前期的研究也發(fā)現(xiàn)GSPE可以延緩動(dòng)脈粥樣硬化、抗心律失常,對(duì)db/db小鼠主動(dòng)脈、心臟、腎臟、視網(wǎng)膜等組織均有保護(hù)作用,對(duì)糖尿病大鼠周圍神經(jīng)也有保護(hù)作用,還可以調(diào)節(jié)糖尿病大鼠腎組織谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶M(GSTM)的表達(dá)。然而,GSPE在高血壓心肌纖維化中的作用及機(jī)制研究未見(jiàn)報(bào)道。心肌纖維化的主要病理改變是心肌間質(zhì)內(nèi)心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblast cells,CFs)增殖、分化、遷移,致膠原蛋白異常沉積增多、降解減少。既往主要從血流動(dòng)力學(xué)、氧化應(yīng)激、炎癥及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-1/smads家族蛋白3(TGFβ-1/smad3)等信號(hào)通路方面研究延緩MF進(jìn)展的作用及機(jī)制。最近的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞骨架蛋白調(diào)節(jié)蛋白與MF也密切相關(guān)。絲切蛋白-1(cofilin-1)是細(xì)胞骨架蛋白即F-肌動(dòng)蛋白(F-action)的調(diào)節(jié)蛋白,其活性主要通過(guò)磷酸化/去磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)。在cofilin-1中,LIM激酶(LIM kinase,LIMK)可通過(guò)結(jié)合Ser-3氨基末端的LIMK1和LIMK2的磷酸化位點(diǎn)對(duì)cofilin-1進(jìn)行專一性磷酸化。目前發(fā)現(xiàn)Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho-activated kinase,ROCK)等Rho(Ras homologue)家族成員均可在上游通過(guò)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)激活LIMK,進(jìn)而激發(fā)cofilin-1的去磷酸活性。既往研究還發(fā)現(xiàn)RhoA/ROCK通路與一些器官的慢性纖維化有關(guān)。我們課題組前期也運(yùn)用定量標(biāo)記比較蛋白質(zhì)組學(xué)(iTRAQ)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn),cofilin-1在高血壓心肌纖維化組織中具有重要的差異性表達(dá),提示在MF中發(fā)揮重要的作用。但是,對(duì)于cofilin-1/ROCKl在高血壓心肌纖維化中的作用及GSPE是否也通過(guò)影響cofilin-1發(fā)揮抗心肌纖維化的分子機(jī)制國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。因此本研究的假說(shuō)如下：高血壓心肌纖維化中cofilin-1表達(dá)增高；GSPE具有抗高血壓心肌纖維化的作用,其分子機(jī)制為下調(diào)cofilin-1的表達(dá)。本部分研究選用自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hypertensive rats,SHRs)進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn),應(yīng)用心臟超聲、心肌組織的各種染色法及電子透視電鏡觀察心臟宏觀結(jié)構(gòu)、心臟功能、心肌纖維化病理改變及心肌超微結(jié)構(gòu),來(lái)明確GSPE對(duì)高血壓心肌纖維化的作用；應(yīng)用組織免疫熒光染色法明確cofilin-1在心肌組織中的表達(dá)及定位；應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)、蛋白質(zhì)印跡法(western blot)、實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time quantitative RT-PCR)法從分子水平明確GSPE抗心肌纖維化的作用及分子調(diào)控機(jī)制。目的1.研究GSPE對(duì)SHR抗心肌纖維化的作用。2.研究cofilin-1介導(dǎo)的GSPE抗SHR心肌纖維化的分子調(diào)控機(jī)制。方法1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組20周齡雄性SHR大鼠24只,分為(1)高劑量GSPE組(SHRH):250mg/kg/d,灌胃,n=8； (2)低劑量GSPE組(SHRL):灌胃,n=8；(3)對(duì)照組(SHRC):生理鹽水,灌胃,n=8。此外,選擇8只WKY鼠做空白對(duì)照(WKYC),對(duì)比觀察高血壓的進(jìn)展。試養(yǎng)一周進(jìn)入實(shí)驗(yàn),治療22周末處死動(dòng)物。2. 一般指標(biāo)的測(cè)定(1)血壓及心率檢測(cè)：每?jī)芍苣┘疤幩狼巴ㄟ^(guò)BP2006A智能鼠尾無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)檢測(cè)各組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓及心率。(2)血液生化指標(biāo)及心衰指標(biāo)的測(cè)定：實(shí)驗(yàn)前大鼠頸靜脈取血,大鼠處死后心臟取血,檢測(cè)血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白-C (LDL-C)、N末端腦鈉肽前體(NT-ProBNP)。3. 心臟宏觀結(jié)構(gòu)和功能的測(cè)定：(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前及GSPE治療22周末采用二維、M超和組織多普勒超聲心動(dòng)圖技術(shù)檢測(cè)大鼠的左心室結(jié)構(gòu)、收縮和舒張功能變化。(2)大鼠處死前稱量大鼠體重(body weight, BW)及處死后稱量心臟重量(heart weight, HW),并計(jì)算心臟重量指數(shù)HW/BW(mg/g)。4.心肌病理組織學(xué)的測(cè)定(1)心肌組織纖維化程度的測(cè)定：HE染色觀察心肌組織病理形態(tài)變化,masson染色觀察膠原纖維面積,天狼星紅染色觀察各型膠原纖維的分布；免疫組化法測(cè)定大鼠心肌組織中α-SMA、collagen I的蛋白表達(dá)情況；(2)心肌超微結(jié)構(gòu)觀察：透射電鏡觀察心肌組織細(xì)胞內(nèi)肌絲、肌節(jié)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基復(fù)合體等超微結(jié)構(gòu)；5.心肌組織中基因、蛋白表達(dá)檢測(cè)：western blot及RT-PCR法測(cè)定大鼠心肌組織中α-SMA、collagen I、MMP-9、TIMP-1表達(dá)情況；組織免疫熒光染色、western blot及RT-PCR法測(cè)定大鼠心肌組織中cofilin-1的表達(dá)情況；western blot及RT-PCR法測(cè)定大鼠心肌組織中ROCK1的表達(dá)情況；western blot及RT-PCR法測(cè)定大鼠心肌組織中TGFβ-1、Smad3、-smad3的表達(dá)情況。6.心肌組織氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)：EILISA法測(cè)定大鼠心肌組織的U2O2、NO、 MDA、SOD的蛋白表達(dá)；western blot法測(cè)定大鼠心肌組織中Nrf2的表達(dá)情況。結(jié)果1. GSPE對(duì)SHR一般情況的影響實(shí)驗(yàn)前,與WKYC組比較,SHR組在體重方面無(wú)差異(P0.05),在心率、收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓方面均顯著升高(P0.01),而SHR組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；GSPE治療22周末,與WKYC組比較,SHR各組在體重方面比較仍無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),但是,在心率、收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓方面比較仍均顯著升高(P0.01)；與SHR對(duì)照組比較,SHR治療組在心率、收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓方面較低(P0.05),但GSPE治療的高低劑量組間無(wú)顯著差異(P0.05)。GSPE治療前后,實(shí)驗(yàn)鼠各組在血脂及心衰指標(biāo)方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2. GSPE對(duì)SHR心臟宏觀結(jié)構(gòu)及功能的影響(1)心臟超聲指標(biāo)：與實(shí)驗(yàn)前比較,GSPE治療22周末,WKYC組舒張功能指標(biāo)E'/A'顯著下降(P0.01),IVSd顯著增厚(P0.01),LVPWd顯著增厚(P0.01)。與實(shí)驗(yàn)前比較,GSPE治療22周末,SHR各組舒張功能指標(biāo)E'/A'顯著下降(P0.01),LVEF升高(P0.01或P0.05),LVIDd縮小(P0.01或P0.05),IVSd顯著增厚(P0.01),LVPWd顯著增厚(P0.01)。實(shí)驗(yàn)前,與WKYC組比較：SHR各組E'/A'顯著下降(P0.01),IVSd顯著增厚(P0.01)。GSPE治療22周末,與WKYC組比較：SHR各組的E'/A'顯著下降(P0.01)；SHRC組LVEF升高(P0.05)；SHR各組IVSd增厚(P0.01或P0.05),LVPWd顯著增厚(P0.01)。GSPE治療22周末,與SHRC比較：GSPE治療組SHR的E'/A'顯著增加(P0.01),LVEF顯著下降(P0.01),LVIDd增大(P0.01或P0.05),IVSd變薄(P0.05),LVPWd變薄(P0.01)。GSPE治療22周末,SHRH組與SHRL組比較：E'/A'增加(P0.05),LVEF下降(P0.05),IVSd變薄更顯著(P0.05),LVPWd變薄更顯著(P0.01)。(2)心臟大體標(biāo)本顯示：與WKYC組比較,SHR各組心臟增大。定量分析心臟重量/體重比值(HW/BWmg/g)結(jié)果顯示：與WKYC組比較,SHR各組均有增高(P0.05或P0.01)；與SHRC比較,SHR治療組有降低趨勢(shì),但無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。3. GSPE抗SHR心肌纖維化的組織病理學(xué)結(jié)果(1)心肌HE染色：WKYC大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)、橫紋、閏盤及細(xì)胞核正常；肌纖維無(wú)斷裂�？v切面觀察：SHR各組細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)顆粒狀物質(zhì),細(xì)胞腫大變形。大部分細(xì)胞無(wú)明顯間隙,細(xì)胞核肥大或固縮。心肌纖維斷裂并融合呈波浪狀,有些橫紋、閏盤尚清晰。SHR治療組較SHRC,心肌細(xì)胞腫脹減輕,心肌纖維斷裂減少,大部分橫紋、閏盤清晰。橫截面觀察：?jiǎn)蝹�(gè)細(xì)胞面積增加,直徑增寬；SHR治療組較SHR對(duì)照組,心肌細(xì)胞直徑增寬減輕,單個(gè)心肌細(xì)胞面積縮小。(2)心肌masson染色：縱切面觀察：與WKYC組比較,SHR各組大鼠的心肌間質(zhì)、心內(nèi)膜下膠原纖維顯著增多,且排列走行紊亂。橫截面觀察：可見(jiàn)血管管腔周圍膠原纖維顯著增多。與SHRC組大鼠相比,SHR治療組大鼠心肌間質(zhì)、心內(nèi)膜下及血管管腔周圍膠原纖維顯著減少,SHRH組較SHRL組改善更顯著。膠原纖維面積(CVF)相對(duì)比值及管周膠原面積/管腔面積(PVCA/LA)的相對(duì)比值結(jié)果顯示：與WKYC組大鼠相比,SHR各組大鼠的膠原纖維表達(dá)量顯著增多(CVF,P0.01; PVCA/LA,P0.01); SHR治療組與SHR對(duì)照組比較CVF及PVCA/LA均顯著減少(P0.01),且SHRH組較SHRL組減少更顯著(P0.05)。(3)心肌天狼星紅染色：WKYC組膠原纖維分布少,且血管周圍少有分布。SHR各組均顯示膠原纖維顯著增多,排列紊亂、斷裂,血管周圍更多見(jiàn),以Ⅰ型膠原纖維為主；SHR治療組較對(duì)照組膠原纖維分布減少,排列紊亂減輕,斷裂較少,血管周圍分布顯著減少,且上述情況高劑量組較低劑量組改善均顯著。(4)心肌超微結(jié)構(gòu)觀察：WKYC組大鼠中,肌原纖維排列規(guī)整、稀少；肌小節(jié)結(jié)構(gòu)正常,Z線和明暗帶清晰；閏盤結(jié)構(gòu)正常。SHR各組大鼠中,膠原纖維排列紊亂、豐富；肌小節(jié)結(jié)構(gòu)破壞；肌絲溶解；Z線斷裂成波浪狀；線粒體增生、排列紊亂,形態(tài)腫大變形,出現(xiàn)電子透亮區(qū),看不到嵴,且取代肌絲溶解的區(qū)域；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體發(fā)達(dá),提示分泌功能增強(qiáng)；細(xì)胞核腫大變形,核膜呈缺口狀,染色質(zhì)成團(tuán)狀。SHR治療組大鼠較對(duì)照組大鼠Z線斷裂改變程度減輕,肌絲溶解消失,被增生的線粒體取代的區(qū)域減少；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體稍欠發(fā)達(dá),提示合成分泌功能稍減低。(5)心肌免疫組化：α-SMA及collagen I蛋白主要在心肌間質(zhì)和胞漿中表達(dá)。WKYC組中少量表達(dá),呈條索狀、平行/波浪狀與肌纖維長(zhǎng)軸平行排列,小血管周圍呈不連續(xù)分布。SHR各組表達(dá)顯著增多,排列紊亂,血管周圍分布為主。SHR治療組較SHR對(duì)照組表達(dá)減少。半定量統(tǒng)計(jì)分析顯示：與WKYC組大鼠相比,SHR各組α-SMA、 collagen I表達(dá)顯著增高(P0.01或P0.05)；SHR治療組與SHR對(duì)照組比較表達(dá)顯著減少(P0.05),且呈劑量依賴性(P0.05)。4. GSPE抗SHR心肌纖維化的分子機(jī)制4.1 GSPE對(duì)SHR心肌纖維化組織中α-SMA、collagen I、MMP-9、TIMP-1基因及蛋白表達(dá)的影響RT-PCR結(jié)果：與WKYC組相比,SHR各組中TIMP-1mRNA表達(dá)顯著增多(P0.01),但SHR治療組較SHR對(duì)照組表達(dá)減少(P0.01或P0.05),且呈劑量依賴性(P0.05)。與WKYC組相比,SHR各組中MMP-9mRNA表達(dá)顯著減少(P0.01或P0.05),但SHR治療組較SHR對(duì)照組表達(dá)減少(P0.01),且呈劑量依賴性(P0.01)。Western blot結(jié)果：與WKYC組相比,SHR各組中α-SMA、collagen I、 TIMP-1表達(dá)顯著增多(P0.01/P0.05),但SHR治療組較SHR對(duì)照組表達(dá)顯著減少(P0.01或P0.05),且呈劑量依賴性(P0.01或P0.05)。與WKYC組相比,SHR各組中MMP-9表達(dá)顯著減少(P0.01或P0.05),SHR治療組較SHR對(duì)照組表達(dá)增多(P0.01或P0.05),且均呈劑量依賴性(P0.01或P0.05)。4.2 GSPE抑制SHR心肌纖維化組織中cofilin-1基因及蛋白的表達(dá)Cofilin-1的表達(dá)及定位：免疫熒光染色顯示,各組心肌組織中cofilin-1蛋白主要在心肌間質(zhì)中表達(dá)。RT-PCR結(jié)果：SHR各組與WKYC組相比,cofilin-1 mRNA表達(dá)顯著增多(P0.05)；SHR治療組較SHR對(duì)照組cofilin-1 mRNA的表達(dá)減少(P0.05),SHRH組較SHRL組cofilin-1 mRNA表達(dá)有減少的趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。Western blot結(jié)果：SHR各組與WKYC組相比,cofilin-1表達(dá)顯著增多(P0.01)；SHR治療組較SHR對(duì)照組cofilin-1表達(dá)顯著減少(P0.01或P0.05),SHRH組較SHRL組cofilin-1表達(dá)有減少的趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。4.3 GSPE抑制SHR心肌纖維化組織中ROCK1基因及蛋白的表達(dá)RT-PCR結(jié)果：SHR組與WKYC組相比ROCKlmRNA表達(dá)顯著增多(P0.01)；SHR治療組較SHR對(duì)照組ROCKlmRNA的表達(dá)減少(P0.05),SHRH組較SHRL組ROCKlmRNA表達(dá)有減少的趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。Western blot結(jié)果：SHR組與WKYC組相比,ROCK1表達(dá)顯著增多(P0.01)；SHR治療組較SHR對(duì)照組ROCK1表達(dá)顯著減少(P0.01或P0.05),SHRH組較SHRL組ROCK1表達(dá)有減少的趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。4.4 GSPE抑制SHR心肌纖維化組織中TGFβ-1/smad3信號(hào)通路基因和蛋白的表達(dá)RT-PCR結(jié)果：SHR各組與WKYC組相比TGFβ-1mRNA表達(dá)顯著增多(P0.01),但SHR治療組較SHR對(duì)照組TGFβ-1mRNA的表達(dá)減少(P0.01),且呈劑量依賴性(P0.05)Western blot結(jié)果：SHR各組與WKYC組相比,TGFβ-1、smad3及P-smad3表達(dá)均顯著增多(P0.01)；SHR治療組較SHR對(duì)照組,TGF β-1、p-smad3表達(dá)顯著減少(P0.01或P0.05),且呈劑量依賴性(P0.01)。5. GSPE對(duì)SHR心肌氧化應(yīng)激的影響ELISA法測(cè)定氧化應(yīng)激指標(biāo)：SHR各組較WKYC組H2O2及NO含量均顯著增多(P0.05或P0.01),SHR組間均無(wú)顯著差異(P0.05)；SHR各組較WKYC組MDA及SOD均顯著減少(P0.01),MDA在SHR組間無(wú)顯著差異(P0.05),但SOD在SHR治療組較SHR對(duì)照組顯著增多(P0.05),且呈劑量依賴性(P0.05)。Western blot法測(cè)定Nrf2蛋白表達(dá)：SHR各組與WKYC組相比,Nrf2蛋白表達(dá)顯著下降(P0.01),但SHR治療組較SHR對(duì)照組Nrf2蛋白表達(dá)顯著升高(P0.01或P0.05),且呈劑量依賴性(P0.01)。結(jié)論1. GSPE能夠顯著抑制SHR的心肌纖維化,對(duì)心肌結(jié)構(gòu)及功能損傷起到保護(hù)作用。2. GSPE通過(guò)抑制cofilin-1、ROCK1蛋白表達(dá)發(fā)揮抗高血壓心肌纖維化的作用。3.SHR心肌中cofilin-1表達(dá)顯著增加,且主要分布于心肌間質(zhì)內(nèi),在MF中具有重要的調(diào)節(jié)作用。背景心肌纖維化是多種心臟疾病,如高血壓心臟病、心肌梗死、心肌病、糖尿病心肌病等發(fā)展到一定階段的共同病理改變。心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts,CFs)是存在于心肌間質(zhì)內(nèi),通過(guò)增殖、分化和遷移增加分泌等功能,從而導(dǎo)致MF的主要效應(yīng)細(xì)胞。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)骨架蛋白調(diào)節(jié)蛋白與MF及細(xì)胞增殖、分化、遷移等密切相關(guān)。因此明確CFs分化的機(jī)制,并尋找有效的治療和預(yù)防措施,對(duì)于進(jìn)一步闡明心肌纖維化的機(jī)制及尋找有效的治療藥物具有深遠(yuǎn)的意義。Cofilin-1是存在于真核生物中的一種低分子量(21 kD)的肌動(dòng)蛋白(actin)結(jié)合蛋白,其基本功能是增強(qiáng)肌動(dòng)蛋白絲的轉(zhuǎn)換。Cofilin-1可以通過(guò)切割活性推進(jìn)actin轉(zhuǎn)變?yōu)槭鵂罱Y(jié)構(gòu),可以增加F-actin的拆卸率,改變G-actin的循環(huán)速度,從而重塑actin構(gòu)架,影響細(xì)胞的生理運(yùn)動(dòng)、病理改變。既往的研究發(fā)現(xiàn),在體外細(xì)胞水平,cofilin-1主要影響細(xì)胞的遷移和增值；在體內(nèi),cofilin-1的研究主要在腫瘤領(lǐng)域,如在乳腺腫瘤細(xì)胞的侵襲性亞群中檢測(cè)到mRNA水平的cofilin-1的自發(fā)性過(guò)度表達(dá),在口腔鱗狀細(xì)胞癌、腎細(xì)胞癌、卵巢癌中的cofilin-1高度表達(dá)。近年的研究發(fā)現(xiàn)cofilin-1失活可導(dǎo)致蛋白尿；在高血壓腎臟中通過(guò)參與調(diào)節(jié)抗炎增加腎臟的損害；在大動(dòng)脈中通過(guò)參與調(diào)解抗氧化應(yīng)激增加動(dòng)脈結(jié)構(gòu)及功能的損害；在心血管領(lǐng)域,有文獻(xiàn)證實(shí)cofilin-1在主動(dòng)脈夾層組織中的表達(dá)量較正常組織顯著減少,與平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的排列、增殖、遷移密切相關(guān),并參與了Rho/ROCK相關(guān)的信號(hào)通路。Pho M等還報(bào)道cofilin-1是心臟瓣膜疾病中肌成纖維細(xì)胞分化的重要標(biāo)志。在本研究的第一部分發(fā)現(xiàn)：高血壓大鼠心肌組織間質(zhì)中cofilin-1表達(dá)增加；代表CFs細(xì)胞分化的α-SMA的表達(dá)也顯著增加；同時(shí)發(fā)現(xiàn)GSPE可以同時(shí)下調(diào)cofilin-1及α-SMA在心肌纖維化組織中的表達(dá)。上述結(jié)果提示,GSPE可能通過(guò)調(diào)節(jié)CFs中cofilin-1的表達(dá),減少CFs向肌成纖維細(xì)胞(myocardial fibroblasts, MFs)的分化及膠原蛋白的合成,從而起到抗心肌纖維化的作用。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-1是最重要的促纖維化生長(zhǎng)因子,為諸多因素所致MF的共同通路。既往研究發(fā)現(xiàn)：體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染TGFβ-1可誘導(dǎo)MF；體外具有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)生成及降解等多種作用；且與多種信號(hào)通路,如Rho/ROCK等串聯(lián)交話。膠原蛋白(collagen)為人體主要的細(xì)胞外間質(zhì)成分,主要包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和V型,collagen I的合成增多、降解減少及異位沉積是MF的病理基礎(chǔ)。而內(nèi)源性家族蛋白酶,即基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)及金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of matalloproteinase,TIMPs)則分別促進(jìn)及抑制collagen的降解,其中MMP-9及TIMP-1及3研究最為廣泛。因此,MMP-9及TIMP-1被廣泛用于檢測(cè)膠原蛋白的降解。另外,CFs分化為MFs后,具有更強(qiáng)的合成及分泌膠原蛋白的能力,且α-SMA的表達(dá)明顯增加,所以α-SMA已被大量研究作為檢測(cè)CFs分化的標(biāo)志。本研究的第一部分也發(fā)現(xiàn),高血壓心肌纖維化組織中cofilin-1、 TGFβ-1、α-SMA、collagen Ⅰ、TIMP-1的表達(dá)均顯著性升高,MMP-9顯著性降低；同時(shí)發(fā)現(xiàn)GSPE干預(yù)治療后cofilin-1、TGFβ-1、α-SMA、collagen Ⅰ、 TIMP-1的表達(dá)均顯著性下降,MMP-9顯著性升高。因此,為進(jìn)一步探討cofilin-1介導(dǎo)的GSPE抗心肌纖維化的分子調(diào)控機(jī)制,本部分體外實(shí)驗(yàn),我們采用了TGFβ-1刺激CFs分化,并給予cofilin-1干擾慢病毒和GSPE干預(yù),應(yīng)用western blot法檢測(cè)細(xì)胞的分化及膠原蛋白的合成、降解,從而進(jìn)一步闡明cofilin-1在心肌纖維化中的分子調(diào)控機(jī)制及GSPE的干預(yù)靶點(diǎn)。目的1. 研究cofilin-1在CFs分化及膠原蛋白合成中的分子調(diào)控機(jī)制。2. 研究cofilin-1介導(dǎo)的GSPE抑制CFs分化和膠原蛋白合成的分子機(jī)制。方法1. CFs的培養(yǎng)及分化：(1)在時(shí)間梯度實(shí)驗(yàn)中,人類CFs (human CFs,HCFs)應(yīng)用10 ng/ml的TGFβ-1分別刺激0、24、48和72小時(shí)；在濃度梯度實(shí)驗(yàn)中,我們應(yīng)用0、5、10和50ng/ml的TGFβ-1刺激HCFs48小時(shí)。收集細(xì)胞,提取蛋白,檢測(cè)a-SMA和cofilin-1的表達(dá)情況。(2)根據(jù)轉(zhuǎn)染病毒的不同,將細(xì)胞分為4組：1)PBS空白對(duì)照組：只加PBS,不加其他干預(yù)；2) TGFβ-1刺激對(duì)照組：僅給予TGFβ-1刺激；3) TGFβ-1刺激+LV-CON-RNAi:轉(zhuǎn)染攜帶亂序siRNA慢病毒；4) TGFβ-1刺激+LV-CFL1-RNAi:轉(zhuǎn)染攜帶CFL-RNAi (28562-1)的慢病毒。1)組給予PBS,2)、3)和4)組給予10ng/ml的TGFβ-1刺激,培養(yǎng)48h,收集細(xì)胞。(3)根據(jù)GSPE干預(yù)不同,將細(xì)胞分為4組：1) TGFβ-1刺激對(duì)照組；2) TGFβ-1刺激+LV-CFL1-RNAi;3) GSPE+TGFβ-1刺激+LV-CFL1-RNAi;4) GSPE+TGFβ-1刺激組；1)和2)組單純應(yīng)用培養(yǎng)基培養(yǎng),3)和4)組培養(yǎng)基內(nèi)加入GSPE,調(diào)整GSPE濃度為50ug/ml進(jìn)行培養(yǎng)。各組均給予lOng/ml的TGFβ-1刺激48h,收集細(xì)胞。2. 倒置熒光顯微鏡：檢測(cè)攜帶報(bào)告基因GFP的慢病毒轉(zhuǎn)染效果。3. Western blot:收集細(xì)胞,提取蛋白,檢測(cè)CFs內(nèi)α-SMA、cofilin-1、 collagenⅠ、MMP-9和TIMP-1蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果1. CFs分化對(duì)cofilin-1蛋白表達(dá)的影響Cofilin-1蛋白的表達(dá)呈CFs分化程度依賴性增加,即隨α-SMA蛋白的表達(dá)增強(qiáng)而增強(qiáng),當(dāng)α-SMA蛋白的表達(dá)最強(qiáng)時(shí),cofilin-1蛋白的表達(dá)也最強(qiáng)。α-SMA和cofilin-1蛋白表達(dá)呈TGFβ-1刺激時(shí)間依賴性增加(P0.01)：24小時(shí)開(kāi)始α-SMA和cofilin-1蛋白表達(dá)開(kāi)始顯著增高(P0.01),48小時(shí)達(dá)最高(P0.01),48小時(shí)和72小時(shí)之間無(wú)顯著差異(P0.05)。α-SMA和cofilin-1蛋白的表達(dá)呈TGFβ-1刺激濃度依賴性增加(P0.01 ); 5ng/mlTGFβ-1刺激組α-SMA和cofilin-1蛋白表達(dá)開(kāi)始顯著增高(P0.01) , 10ng/mlTGF β-1刺激組表達(dá)最高,50ng/ml和lOng/ml TGF β-1刺激組間上述蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。2. HCFs中慢病毒干擾cofilin-1的效率和效果將CON-RNAi、CFLl-RNAi(28560-1)、 CFLl-RNAi(28561-1)及CFL1-RNAi(28562-1)分別轉(zhuǎn)染HCFs,轉(zhuǎn)染72小時(shí)后觀察慢病毒攜帶的報(bào)告基因GFP的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)感染效率均大于70%,進(jìn)而收集細(xì)胞、提取蛋白進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明,CFLl-RNAi(28560-1)、 CFLl-RNAi(28561-1)及CFL1-RNAi(28562-1)轉(zhuǎn)染致cofilin-1蛋白表達(dá)分別減少52%、88%和92%,進(jìn)而篩選出最有效的干擾位點(diǎn)CFLl-RNAi(28562-1)用于隨后細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中LV-CFL1-RNAi相關(guān)組的轉(zhuǎn)染。3. Cofilin-1對(duì)CFs分化、膠原蛋白合成的促進(jìn)作用及對(duì)膠原蛋白降解的抑制作用與PBS的空白對(duì)照組比較,TGF0-1刺激的各組細(xì)胞α -SMAn collagen I及TIMP-1蛋白的表達(dá)均顯著性升高(P0.01),MMP-9蛋白的表達(dá)均顯著性降低(P0.01)；與TGFP-1刺激的對(duì)照組比較,TGFe-1刺激+LV-CFL1-RNAi組α-SMA、 collagen I及TIMP-1蛋白的表達(dá)均顯著性降低(P0.01),MMP-9蛋白的表達(dá)顯著性升高(P0.01)；TGF3-1刺激+LV-CON-RNAi組上述蛋白的表達(dá)均無(wú)顯著變化(P0.05)。4. GSPE對(duì)CFs中cofilin-1蛋白表達(dá)的抑制作用與TGFP-1刺激的對(duì)照組比較,GSPE+TGFP-1組cofilin-1蛋白的表達(dá)顯著性降低(P0.01),TGFP-1刺激+LV-CFLl-RNAi組cofilin-1蛋白的表達(dá)顯著性降低(P0.01),GSPE+TGF P -1刺激+LV-CFLl-RNAi組cofilin-1蛋白的表達(dá)顯著性降低(P0.01)；與GSPE+TGF P -1組比較,TGF P -1刺激+LV-CFLl-RNAi組cofilin-1蛋白的表達(dá)顯著性降低(P0.01)；GSPE+TGF-1刺激+LV-CFL1-RNAi組cofilin-1蛋白的表達(dá)顯著性降低(P0.01)；與TGF β-1刺激+LV-CFL1-RNAi組比較,GSPE+TGF β-1刺激+LV-CFL1-RNAi組上述蛋白表達(dá)均無(wú)顯著差異(P0.05)。5. GSPE對(duì)CFs分化、膠原蛋白合成的抑制作用及對(duì)膠原蛋白降解的增強(qiáng)作用與TGF β-1刺激對(duì)照組比較,GSPE+TGF β-1組α-SMA、collagen I及TIMP-1蛋白的表達(dá)均顯著降低(P0.01),MMP-9蛋白的表達(dá)均顯著增加(P0.01);與TGFβ-1刺激對(duì)照組比較,TGFβ-1刺激+LV-CFL1-RNAi組α-SMA、 collagen I及TIMP-1蛋白的表達(dá)均顯著性降低(P0.01),MMP-9蛋白的表達(dá)均顯著性升高(P0.01)；GSPE+TGFβ-1刺激+LV-CFL1-RNAi組α-SMA、 collagen I及TIMP-1蛋白的表達(dá)均顯著性降低(P0.01),MMP-9蛋白的表達(dá)均顯著性增加(P0.01)；與GSPE+TGF β-1組比較,TGF β-1刺激-HLV-CFL1-RNAi組α-SMA、 collagen I及TIMP-1蛋白的表達(dá)均顯著性降低(P0.01),MMP-9蛋白的表達(dá)均顯著性升高(P0.01)；GSPE+TGFβ-1刺激+LV-CFL1-RNAi組α-SMA、 collagen I及TIMP-1蛋白的表達(dá)均顯著性降低(P0.01),MMP-9蛋白的表達(dá)均顯著性增加(P0.01)；與TGFβ-1刺激+LV-CFL1-RNAi組比較,GSPE+TGFβ-1刺激+LV-CFL1-RNAi組上述蛋白表達(dá)均無(wú)顯著差異(P0.05)。結(jié)論1. Cofilin-1促進(jìn)CFs分化,增加膠原蛋白合成、減少膠原蛋白降解。2. GSPE通過(guò)抑制CFs中cofilin-1的表達(dá),減少CFs分化,進(jìn)而減少膠原蛋白合成、增加其降解,從而起到抗心肌纖維化的作用,cofilin-1可能是GSPE的干預(yù)靶點(diǎn)。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R544.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2502222