【摘要】：研究背景:肺高壓(pulmonary hypertension,PH)是引起右心衰竭和猝死的主要原因,根據(jù)病因和發(fā)病特點(diǎn)不同,國(guó)際上將肺高壓分為五大類,其中的第二大類——左心疾病相關(guān)肺高壓(pulmonary hypertension due to left heart diseases,PH-LHD)在臨床上發(fā)病率最高、最常見[1]。引起PH-LHD最常見的左心疾病(left heart diseases,PLHD)包括心力衰竭和心臟瓣膜病。LHD導(dǎo)致左心負(fù)荷增高時(shí),壓力逆向傳遞引起的肺靜脈壓力升高,是導(dǎo)致肺血管重構(gòu)和PH的常見初始原因,但也有研究表明PH形成后,即使解除引起壓力升高的因素,肺血管重構(gòu)和PH仍然會(huì)繼續(xù)進(jìn)展[2],提示LHD導(dǎo)致PH時(shí),可能還存在其他機(jī)制。PH是引起LHD患者癥狀加重的原因,與預(yù)后不良密切相關(guān)。但臨床上,PH-LHD難以做到早期發(fā)現(xiàn)和診斷,因?yàn)镻H-LHD常見表現(xiàn),包括氣短、乏力、活動(dòng)耐量降低等,并不特異,往往和LHD引起的癥狀難以鑒別。PH是一個(gè)血流動(dòng)力學(xué)概念,右心導(dǎo)管(right Heart Catheter,RHC)檢查是診斷PH-LHD的金標(biāo)準(zhǔn),但目前RHC并不是LHD患者的一個(gè)常規(guī)檢查[1],同時(shí)RHC具有有創(chuàng)性,限制了其臨床應(yīng)用及LHD患者PH的診斷。超聲心動(dòng)圖依然是臨床上診斷PH-LHD重要的手段,超聲心動(dòng)圖雖然在明確病因和判斷右心功能損害方面有不可替代的優(yōu)越性,但在估測(cè)肺動(dòng)脈壓方面尚有不足[3]。因此尋找新的更靈敏特異的檢查手段有重要的臨床意義。同時(shí),目前臨床上尚沒有針對(duì)PH-LHD的有效治療方法,前列環(huán)素類和吸入性NO等藥物雖能暫時(shí)降低肺動(dòng)脈壓力,卻不能逆轉(zhuǎn)PH-LHD的進(jìn)展,也不能改善疾病的長(zhǎng)期預(yù)后[4,5]。因此,進(jìn)一步探索PH-LHD發(fā)生發(fā)展的機(jī)制,對(duì)其早期發(fā)現(xiàn)和治療均有重要作用。生物標(biāo)志物是PH診斷研究中的重點(diǎn),如腦鈉肽、IL-6、膽紅素和尿酸等,與PH患者的預(yù)后相關(guān),但對(duì)PH的早期診斷缺乏很好的特異性[6,7]。目前研究最多的是腦鈉肽和腦鈉肽前體,但因容易受到患者腎功能的影響,降低了其特異性[8]。穩(wěn)定存在于體液中的循環(huán)微小RNA(Micro RNA),已成為新的研究熱點(diǎn),循環(huán)Micro RNA的分布在不同病理狀態(tài)下會(huì)發(fā)生特定的變化,可作為檢測(cè)癌癥、心血管疾病和糖尿病等重大疾病早期的新型生物標(biāo)志物[9,10],但與PH-LHD相關(guān)的循環(huán)micro RNA的分析及作用鮮有報(bào)道。因此篩選PH-LHD早期血清中表達(dá)變化的micro RNA,為尋找特異生物標(biāo)志物提供線索。作為進(jìn)化上保守的內(nèi)源性非編碼RNA,Micro RNA在轉(zhuǎn)錄后水平起著調(diào)控靶基因的作用[11]。循環(huán)Micro RNA不僅可以作為疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物,還可在細(xì)胞之間傳遞信號(hào),參與PH的發(fā)生發(fā)展。如mi R-143,通過參與肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cell,PASMC)和肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(PAEC)的交流,在缺氧誘發(fā)的PH發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[12]。特定的micro RNA在肺血管壁細(xì)胞功能改變中也有著重要作用,如mi R-21,mi R-27a,mi R-17-92簇,mi R-124簇等,通過引起PAEC功能不全,調(diào)控PASMC的增殖和遷移等途徑,導(dǎo)致血管重構(gòu),參與了PH發(fā)展[13]。而PH-LHD的發(fā)生發(fā)展中的micro RNA研究較少。作為一種敏感的高通量檢查方法,micro RNA芯片能快速篩查出不同樣本間所有已知的micro RNA表達(dá)變化[14]。生物信息學(xué)常用于對(duì)篩查的micro RNA進(jìn)行深入分析,能對(duì)疾病發(fā)生相關(guān)的基因進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、功能注釋及通路分析,加深對(duì)疾病發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識(shí)[14]。左心超負(fù)荷動(dòng)物模型能模擬PH-LHD的病理生理進(jìn)程,是常用的PH-LHD模型[15]。通過芯片篩查模型肺組織中差異表達(dá)的micro RNA,可預(yù)測(cè)與PH-LHD相關(guān)的靶基因位點(diǎn)。進(jìn)一步生物信息學(xué)分析,得出PH-LHD相關(guān)的micro RNA及關(guān)鍵信號(hào)通路,從而為PH-LHD的診斷和治療提供理論依據(jù)。研究目的:通過建立大鼠主動(dòng)脈弓縮窄(transverse aortic constriction,TAC)模型,觀察左心負(fù)荷增高對(duì)肺血流動(dòng)力學(xué)及肺血管重構(gòu)的影響;利用芯片篩選出TAC大鼠模型肺組織表達(dá)變化的micro RNA譜,分析其調(diào)控的靶基因與信號(hào)通路,并在組織和循環(huán)水平上進(jìn)行驗(yàn)證,分析循環(huán)micro RNA變化與血流動(dòng)力學(xué)的相關(guān)性;通過臨床病例驗(yàn)證,進(jìn)一步探索micro RNA對(duì)PH-LHD的預(yù)測(cè)意義。實(shí)驗(yàn)方法:第一部分:1.建模:40只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為Sham組(n=20)和TAC組(n=20),TAC組在主動(dòng)脈弓處以16G針頭墊扎,形成主動(dòng)脈弓縮窄;Sham組不結(jié)扎主動(dòng)脈弓。2.檢測(cè)指標(biāo):1)一般情況;2)心臟超聲檢測(cè)大鼠心臟重構(gòu)和功能;3)心導(dǎo)管檢查明確血流動(dòng)力學(xué)變化;4)病理學(xué)觀察肺血管重構(gòu)。第二部分:1.利用micro RNA芯片檢測(cè)TAC和Sham大鼠肺組織樣本,篩選micro RNA的差異表達(dá)譜,并使用mi R-Path v.3預(yù)測(cè)經(jīng)過聚類的兩組差異micro RNA靶基因,得到靶基因的富集結(jié)果,預(yù)測(cè)PH-LHD相關(guān)信號(hào)通路。2.采用基于SYBR Green熒光染料的方法對(duì)肺組織差異表達(dá)的micro RNA行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)驗(yàn)證;進(jìn)一步檢測(cè)大鼠血清micro RNA水平,并統(tǒng)計(jì)分析其與大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性。第三部分:1.根據(jù)納入排除標(biāo)準(zhǔn)選取于2014年6月至2016年11月在第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科就診患者,以PASP≥50mm Hg作為診斷PH的依據(jù),收集PH-LHD患者34例、單純LHD 46例。采集受試者的基本資料與臨床數(shù)據(jù):年齡、性別、身高、體重、吸煙史、體重指數(shù)、血壓、心率、紐約心功能分級(jí)、心臟超聲檢測(cè)數(shù)據(jù)、BNP。采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)所有受試者血清中micro RNA水平,分析其與臨床數(shù)據(jù)的相關(guān)性。2.使用SPSS軟件(版本20.0,IBM公司,美國(guó))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示,計(jì)數(shù)資料用例數(shù)和百分比表示;組間資料的差異采用Mann-Whitney U非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行分析;采用Spearman相關(guān)系數(shù)評(píng)估m(xù)i R-149水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性;采用logistic回歸進(jìn)行單因素、多因素分析,并計(jì)算得到比值比、95%可信區(qū)間;采用ROC曲線進(jìn)行預(yù)測(cè)價(jià)值分析,并計(jì)算到曲線下面積、敏感度、特異度。結(jié)果:第一部分:1.手術(shù)過程中因麻醉意外、氣胸、主動(dòng)脈破裂原因?qū)е耇AC組3只死亡,Sham組9只死亡;在8周的飼養(yǎng)過程中,觀察到與Sham組相比,TAC組模型體重減輕,四肢及胸前區(qū)出現(xiàn)青紫,精神狀態(tài)欠佳,共計(jì)7只在飼養(yǎng)過程中死亡;最后得到10只TAC模型,11只Sham模型。進(jìn)一步稱重測(cè)量表明,與Sham組相比,TAC組右心肥厚指數(shù)(RVHI)升高(23.46±0.77%vs27.40±2.68%;P=0.010)。2.模型建立8周時(shí),心臟超聲檢查提示,與Sham組(n=11)相比,TAC組(n=10)肺動(dòng)脈直徑增大:2.61(2.50,3.31)mm vs 2.97(2.75,3.25)mm(P0.05);左室射血分?jǐn)?shù)降低:84.99(79.53,88.46)%vs 69.75(56.57,82.61)%(P0.05);左室心肌質(zhì)量增加:573.27(465.68,677.54)mg vs 680.77(588.27,836.55)mg(P0.05);舒張期左室體積增大:160.40(125.04,187.51)ul vs 201.86(162.47,217.21)ul(P0.05)。3.模型建立8周時(shí),右心導(dǎo)管檢查發(fā)現(xiàn),與Sham組(n=11)相比,TAC組(n=10)mean pulmonary arterial pressure(m PAP)升高(16.22±2.23mm Hg vs 22.13±2.74mm Hg;P0.001),其中90%的模型大鼠m PAP介于19-24mm Hg之間,屬于臨界PH;1只模型大鼠m PAP達(dá)到28.64mm Hg,形成PH。同時(shí)LVSP(140.04±28.01mm Hg vs172.22±29.17mm Hg;P0.001)、RVSP(26.66±2.74mm Hg vs 29.12±2.08mm Hg;P=0.031)升高,LV Max(dp/dt)(12278.66±1309.28mm Hg/s vs 9124.76±838.36 mm Hg/s;P0.001)、RV Max(dp/dt)(1892.47±272.69 mm Hg/s vs 1491.78±261.20 mm Hg/s;P=0.003)降低。4.模型建立8周時(shí),肺動(dòng)脈及肺組織行HE染色,觀察到Sham組肺小動(dòng)脈管壁較薄,管腔通暢,未見狹窄,TAC組肺小動(dòng)脈管壁明顯增厚,部分肺小動(dòng)脈出現(xiàn)管腔閉塞,周圍出現(xiàn)細(xì)胞聚集炎癥改變。與Sham組比較,TAC組肺動(dòng)脈中膜厚度百分比增加(27.41±2.38%vs 54.95±4.81%;P=0.027)。進(jìn)一步行免疫熒光染色觀察到TAC組肺小血管管壁增厚,管腔變窄。第二部分:1.以Sham組大鼠肺組織為對(duì)照,經(jīng)micro RNA芯片分析,一共對(duì)385個(gè)micro RNA進(jìn)行檢測(cè)分析,篩選出TAC組水平差異大于1.5倍且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的micro RNA,差異基因經(jīng)過聚類分析排除個(gè)體差異,發(fā)現(xiàn)較Sham組,TAC組上調(diào)的有rno-mi R-143-3p、rno-mi R-181a-5p、rno-mi R-125b-1-3p,下調(diào)的有rno-mi R-206-3p、rno-let-7b-5p、rno-mi R-200b-3p、rno-mi R-21-5p、rno-let-7b-5p、rno-mi R-149-3p,進(jìn)一步KEGG信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)差異變化的micro RNA靶基因(其中包括Tnf、Chrd、Smad2、Smad7、Acvr1c、Acvr2a、Rps6kb1、Smurf2、Bmp5、Tgfbr1)的功能集中于TGF-β信號(hào)通路。2.進(jìn)一步驗(yàn)證大鼠肺組織mi R-149水平,發(fā)現(xiàn)TAC組mi R-149水平下調(diào),RQ值分別為(1.141±0.201vs 0.300±0.028;P0.001)。檢測(cè)TAC大鼠血清mi R-149水平,發(fā)現(xiàn)變化趨勢(shì)與肺組織一致,相對(duì)定量(RQ)值分別為(1.018±0.060vs 0.467±0.047;P0.001);統(tǒng)計(jì)分析循環(huán)mi R-149水平與大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)相關(guān)性分析,循環(huán)mi R-149水平與m PAP(r=-0.752,P0.001)、RVHI(r=-0.643,P=0.002)呈負(fù)相關(guān),與LVSP(r=0.739,P0.001)、RV Max(dp/dt)(r=0.534,P=0.013)、LV Max(dp/dt)(r=0.728,P0.001)呈正相關(guān),與RVSP(r=-0.309,P=0.173)統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)相關(guān)性。第三部分:1.檢測(cè)受試者循環(huán)mi R-149水平,發(fā)現(xiàn)LHD對(duì)照組以及PH-LHD組RQ值分別為1.00(0.73,1.81)vs 0.58(0.49,1.08),經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)析PH-LHD組mi R-149的表達(dá)顯著低于LHD組(P=0.002)。采用Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)受試者循環(huán)mi R-149與PASP(r=-0.286,P=0.010)、左心室舒張末期內(nèi)徑(r=-0.345,P=0.002)、BNP(r=-0.306,P=0.006)、紐約心功能分級(jí)(r=-0.232,P=0.038)呈負(fù)相關(guān);與LVEF呈正相關(guān)(r=0.247,P=0.027)。2.通過logistic回歸分析發(fā)現(xiàn),循環(huán)mi R-149降低,PASP≥50mm Hg發(fā)生的可能性增高。應(yīng)用ROC曲線評(píng)估m(xù)i R-149對(duì)PASP≥50mm Hg發(fā)生的預(yù)測(cè)價(jià)值:AUC=0.699,95%CI:0.579~0.820(P=0.002),其最佳閾值為0.52,敏感度為0.500,特異度為0.891。采用二元Logistic正向逐步回歸篩選出預(yù)測(cè)PASP≥50mm Hg的聯(lián)合標(biāo)志物為左心房舒張末期內(nèi)徑、循環(huán)mi R-149和BNP并獲得其預(yù)測(cè)模型,ROC分析表明預(yù)測(cè)模型曲線下面積(AUC)為0.889(95%CI:0.818~0.960,P0.001),閾值為0.41時(shí)敏感度為0.882,特異度為0.818,較單獨(dú)循環(huán)mi R-149預(yù)測(cè)價(jià)值高。結(jié)論:1.主動(dòng)脈弓縮窄導(dǎo)致左心負(fù)荷增高和左心功能降低的同時(shí),引起肺動(dòng)脈壓輕度增高和右心功能損害。2.主動(dòng)脈弓縮窄導(dǎo)致左心負(fù)荷增高和左心功能降低時(shí),肺組織micro RNA表達(dá)譜發(fā)生變化,其中rno-mi R-143-3p、rno-mi R-181a-5p、rno-mi R-125b-1-3p上調(diào),rno-mi R-206-3p、rno-let-7b-5p、rno-mi R-200b-3p、rno-mi R-21-5p、rno-let-7b-5p、rno-mi R-149-3p下調(diào),KEGG信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)芯片篩選的差異變化micro RNA靶基因的功能集中于TGF-β信號(hào)通路。3.動(dòng)物模型中TAC組大鼠肺組織和循環(huán)mi R-149水平較Sham組顯著降低。4.與LHD患者相比,PH-LHD患者循環(huán)mi R-149水平顯著降低,循環(huán)mi R-149可作為L(zhǎng)HD患者合并PH的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。聯(lián)合mi R-149、左心房舒張末期內(nèi)徑和BNP預(yù)測(cè)LHD患者合并PH的敏感性為0.882,特異性為0.818。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R544.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 靳鵬;鄭薇;顧文竹;賴亞宇;武曉靜;;左心疾病相關(guān)性肺動(dòng)脈高壓患者血清生化標(biāo)志物的特征[J];中國(guó)循環(huán)雜志;2016年04期

2 黃禮杰;陳潔娣;唐羽欣;劉青;孫曉鷗;譚文;;主動(dòng)脈弓縮窄誘發(fā)左心疾病相關(guān)的大鼠肺動(dòng)脈高壓制備方法[J];廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào);2015年05期

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本文編號(hào)：2501380