【摘要】：作為造血干細(xì)胞的關(guān)鍵能力,自我更新和分化受到細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的共同嚴(yán)密調(diào)控。任何自我更新和分化的調(diào)控異常都可能導(dǎo)致血液疾病發(fā)生。通過(guò)反向遺傳學(xué)的方法我們已經(jīng)知道了一些基因如pten、bmi1、hoxb4、wnt等與造血干細(xì)胞的自我更新密切相關(guān),但是已知的非常有限。因此我們?cè)谝粋�(gè)活體動(dòng)物內(nèi)進(jìn)行全基因組飽和的、表型驅(qū)動(dòng)的、無(wú)主觀誤差的正向遺傳學(xué)篩選�；诎唏R魚(yú)造血系統(tǒng)遺傳學(xué)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與人類有高度的相似性,我們?cè)O(shè)計(jì)應(yīng)用ENU化學(xué)誘變技術(shù),獲得了近1,000個(gè)斑馬魚(yú)F2代隱性遺傳突變家系,采用全胚胎原位雜交技術(shù)在F3代中進(jìn)行篩選,確定影響定向造血干細(xì)胞發(fā)育、遷移和自我更新的突變家系,隨后定位克隆這些關(guān)鍵基因并評(píng)估它們?cè)谌祟愒煅杉?xì)胞疾病和白血病腫瘤干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的地位和作用。目前已有的一些造血相關(guān)突變株,比如影響造血干細(xì)胞的早期發(fā)育的突變株spt(tbx16)、snh(bmp7)等,影響造血分化晚期各系的突變株如sau(als2)、ret(band3),但是直接影響造血干細(xì)胞的突變株很少,如bls等。我們的篩選使用的是定向造血干細(xì)胞的標(biāo)記runx1、c-myb來(lái)做原位雜交,因此篩到的很多突變都與造血干細(xì)胞有著密切的關(guān)系,本論文應(yīng)用c-myb作為造血干細(xì)胞的標(biāo)記進(jìn)行了大規(guī)模三代遺傳學(xué)篩選,發(fā)現(xiàn)了一個(gè)在斑馬魚(yú)腎臟和尾部造血組織(cht)都有很明顯且很特異表達(dá)升高的突變株ldd731。對(duì)這一突變株進(jìn)行了造血表型的詳細(xì)分析,得出以下幾點(diǎn)結(jié)論:1)突變株ldd731定向造血干細(xì)胞有明顯的增加,髓系、紅系、單核巨噬系細(xì)胞也有明顯的增加,而t淋巴細(xì)胞是正常的。定向造血干細(xì)胞的增加從3dpf(dayspost-fertilization)起已經(jīng)可以通過(guò)原位雜交來(lái)區(qū)分,5dpf可以從光鏡下區(qū)分,可看到尾部造血組織(cht)處有非常明顯的細(xì)胞數(shù)目增加。2)突變株ldd731原始造血不受影響,血管形態(tài)正常,其他如神經(jīng)干細(xì)胞和生殖干細(xì)胞染色也是正常的,因此可以確定這個(gè)突變株是非常特異地影響了斑馬魚(yú)的定向造血。3)突變株ldd731純合致死,通常9-14dpf死亡。雜合子可存活,雜合子無(wú)定向造血干細(xì)胞明顯增加的表型。4)磷酸化組蛋白3(ph3)增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)突變株ldd731細(xì)胞增殖明顯增加。全胚胎介導(dǎo)的dutp缺口標(biāo)記(tunel)實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞凋亡沒(méi)有異常。對(duì)突變株進(jìn)行5dpf外周血涂片瑞氏吉姆薩染色,與正常魚(yú)外周血涂片染色相比,各階段細(xì)胞均明顯增加,包括個(gè)體較大、核質(zhì)比很大的形態(tài)明顯偏向于干、祖細(xì)胞的原始細(xì)胞。蘇丹黑染色和o-dianisidine血紅蛋白檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)粒細(xì)胞和紅細(xì)胞成熟正常并有明顯增殖的現(xiàn)象。以上這些都符合骨髓增殖性疾病(mpd),也稱為骨髓增殖性惡性腫瘤(mpn)。隨后我們對(duì)這一突變株進(jìn)行了定位克隆,最終將突變基因定位在了斑馬魚(yú)15號(hào)染色體上的c-cbl基因,突變位點(diǎn)是第1144位堿基,從c突變?yōu)閠,使第382位氨基酸從組氨酸突(h)變成了酪氨酸(y),突變位于這個(gè)基因非常保守的ring結(jié)構(gòu)域。目前研究表明,c-cbl基因是一個(gè)負(fù)向調(diào)控自我更新和細(xì)胞周期的一個(gè)基因,是一個(gè)抑癌基因,并且它是一個(gè)e3泛素蛋白連接酶,ring結(jié)構(gòu)域的主要功能是負(fù)向調(diào)控蛋白酪氨酸激酶受體。目前這一基因在人和鼠里的研究已很多,已有報(bào)道顯示c-cbl基因突變后與骨髓增殖性疾病或者白血病密切相關(guān)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)我們證實(shí)了ldd731的造血干細(xì)胞增殖表型的出現(xiàn)可能依賴flt3信號(hào)通路,這與小鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致,人類中也發(fā)現(xiàn)了與ldd731突變株位點(diǎn)一樣的突變,相應(yīng)的突變是398位氨基酸,也是從組氨酸突變?yōu)槔野彼?科學(xué)家們對(duì)幾百例骨髓增殖性惡性腫瘤(mpn)c-cbl基因測(cè)序中發(fā)現(xiàn)有該一突變的,當(dāng)然還不能確定地說(shuō)這一位點(diǎn)的突變導(dǎo)致了mpn,但是ldd731突變株給予了直接的證據(jù)�？傮w來(lái)說(shuō),我們的遺傳學(xué)研究是很好的“基因組乒乓”的例子,將人和斑馬魚(yú)里的信息進(jìn)行比較和對(duì)接,有助于我們更好地理解造血干細(xì)胞異常和白血病發(fā)生密切相關(guān)的基因及其機(jī)制。ldd731突變株是目前為止首個(gè)斑馬魚(yú)骨髓增殖性疾病的模型。參與骨髓增殖性疾病或白血病的信號(hào)通路很可能是非常復(fù)雜的,這突變株有助于我們理解信號(hào)通路的異常和致病機(jī)理的相關(guān)性,還可以用作藥物篩選模型,為骨髓增殖性疾病和白血病提供靶向治療研究的手段。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R551.3

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 薛宏亮;張乃元;袁占鵬;;斑馬魚(yú)在神經(jīng)毒理學(xué)研究中的應(yīng)用[J];公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué);2014年02期

2 ;學(xué)科前瞻[J];當(dāng)代醫(yī)學(xué);2003年12期

3 張立鳳;鐘濤;桂永浩;;外源性視黃酸對(duì)斑馬魚(yú)心血管系統(tǒng)發(fā)育的影響[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào);2006年02期

4 楊寒朔;湯明海;鄧洪新;楊金亮;;納升超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)斑馬魚(yú)胚胎中小分子多肽的初步研究[J];四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2007年06期

5 徐娟;吳南翔;;斑馬魚(yú)在環(huán)境內(nèi)分泌干擾物篩選和檢測(cè)中的應(yīng)用[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(衛(wèi)生學(xué)分冊(cè));2009年04期

6 胡瑋;程露陽(yáng);宋韞韜;夏鴻飛;孫大光;李鵬;李丹;陸彩玲;馬旭;;硫代硫酸鈉干擾斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育并致畸[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2009年09期

7 何秋霞;劉可春;楚杰;王思鋒;韓利文;王希敏;;斑馬魚(yú)作為模式生物在心血管疾病研究中的應(yīng)用[J];生命的化學(xué);2009年05期

8 孫淑娜;桂永浩;蔣t，

本文編號(hào)：2500393