【摘要】：作為造血干細胞的關鍵能力,自我更新和分化受到細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子和信號網(wǎng)絡的共同嚴密調(diào)控。任何自我更新和分化的調(diào)控異常都可能導致血液疾病發(fā)生。通過反向遺傳學的方法我們已經(jīng)知道了一些基因如pten、bmi1、hoxb4、wnt等與造血干細胞的自我更新密切相關,但是已知的非常有限。因此我們在一個活體動物內(nèi)進行全基因組飽和的、表型驅(qū)動的、無主觀誤差的正向遺傳學篩選�；诎唏R魚造血系統(tǒng)遺傳學調(diào)控網(wǎng)絡與人類有高度的相似性,我們設計應用ENU化學誘變技術(shù),獲得了近1,000個斑馬魚F2代隱性遺傳突變家系,采用全胚胎原位雜交技術(shù)在F3代中進行篩選,確定影響定向造血干細胞發(fā)育、遷移和自我更新的突變家系,隨后定位克隆這些關鍵基因并評估它們在人類造血干細胞疾病和白血病腫瘤干細胞惡性轉(zhuǎn)化中的地位和作用。目前已有的一些造血相關突變株,比如影響造血干細胞的早期發(fā)育的突變株spt(tbx16)、snh(bmp7)等,影響造血分化晚期各系的突變株如sau(als2)、ret(band3),但是直接影響造血干細胞的突變株很少,如bls等。我們的篩選使用的是定向造血干細胞的標記runx1、c-myb來做原位雜交,因此篩到的很多突變都與造血干細胞有著密切的關系,本論文應用c-myb作為造血干細胞的標記進行了大規(guī)模三代遺傳學篩選,發(fā)現(xiàn)了一個在斑馬魚腎臟和尾部造血組織(cht)都有很明顯且很特異表達升高的突變株ldd731。對這一突變株進行了造血表型的詳細分析,得出以下幾點結(jié)論:1)突變株ldd731定向造血干細胞有明顯的增加,髓系、紅系、單核巨噬系細胞也有明顯的增加,而t淋巴細胞是正常的。定向造血干細胞的增加從3dpf(dayspost-fertilization)起已經(jīng)可以通過原位雜交來區(qū)分,5dpf可以從光鏡下區(qū)分,可看到尾部造血組織(cht)處有非常明顯的細胞數(shù)目增加。2)突變株ldd731原始造血不受影響,血管形態(tài)正常,其他如神經(jīng)干細胞和生殖干細胞染色也是正常的,因此可以確定這個突變株是非常特異地影響了斑馬魚的定向造血。3)突變株ldd731純合致死,通常9-14dpf死亡。雜合子可存活,雜合子無定向造血干細胞明顯增加的表型。4)磷酸化組蛋白3(ph3)增殖檢測實驗發(fā)現(xiàn)突變株ldd731細胞增殖明顯增加。全胚胎介導的dutp缺口標記(tunel)實驗表明細胞凋亡沒有異常。對突變株進行5dpf外周血涂片瑞氏吉姆薩染色,與正常魚外周血涂片染色相比,各階段細胞均明顯增加,包括個體較大、核質(zhì)比很大的形態(tài)明顯偏向于干、祖細胞的原始細胞。蘇丹黑染色和o-dianisidine血紅蛋白檢測進一步證實粒細胞和紅細胞成熟正常并有明顯增殖的現(xiàn)象。以上這些都符合骨髓增殖性疾病(mpd),也稱為骨髓增殖性惡性腫瘤(mpn)。隨后我們對這一突變株進行了定位克隆,最終將突變基因定位在了斑馬魚15號染色體上的c-cbl基因,突變位點是第1144位堿基,從c突變?yōu)閠,使第382位氨基酸從組氨酸突(h)變成了酪氨酸(y),突變位于這個基因非常保守的ring結(jié)構(gòu)域。目前研究表明,c-cbl基因是一個負向調(diào)控自我更新和細胞周期的一個基因,是一個抑癌基因,并且它是一個e3泛素蛋白連接酶,ring結(jié)構(gòu)域的主要功能是負向調(diào)控蛋白酪氨酸激酶受體。目前這一基因在人和鼠里的研究已很多,已有報道顯示c-cbl基因突變后與骨髓增殖性疾病或者白血病密切相關。通過實驗我們證實了ldd731的造血干細胞增殖表型的出現(xiàn)可能依賴flt3信號通路,這與小鼠的實驗結(jié)果相一致,人類中也發(fā)現(xiàn)了與ldd731突變株位點一樣的突變,相應的突變是398位氨基酸,也是從組氨酸突變?yōu)槔野彼?科學家們對幾百例骨髓增殖性惡性腫瘤(mpn)c-cbl基因測序中發(fā)現(xiàn)有該一突變的,當然還不能確定地說這一位點的突變導致了mpn,但是ldd731突變株給予了直接的證據(jù)。總體來說,我們的遺傳學研究是很好的“基因組乒乓”的例子,將人和斑馬魚里的信息進行比較和對接,有助于我們更好地理解造血干細胞異常和白血病發(fā)生密切相關的基因及其機制。ldd731突變株是目前為止首個斑馬魚骨髓增殖性疾病的模型。參與骨髓增殖性疾病或白血病的信號通路很可能是非常復雜的,這突變株有助于我們理解信號通路的異常和致病機理的相關性,還可以用作藥物篩選模型,為骨髓增殖性疾病和白血病提供靶向治療研究的手段。
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【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R551.3

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本文編號：2500393