【摘要】：研究背景外周血管病嚴重危害人類健康,而如何解決缺血發(fā)生后組織修復和功能恢復是目前的研究熱點。炎癥是缺血后組織修復以及血管新生不可或缺的條件,適度的炎癥反應有助于清除壞死組織,促進血管新生,而過度的炎癥反應可加重組織損傷,促進缺血病灶進一步惡化。趨化因子在炎癥細胞浸潤的過程中起到至關重要的作用。已證實多種趨化因子及其受體參與調(diào)控缺血后炎癥細胞的募集,其中包括基質(zhì)衍生因子(SDF-1)及其配體CXCR4.并且已有初步研究顯示SDF-1/CXCR4軸參與調(diào)控缺血后炎癥反應以及血管新生。然而,SDF-1/CXCR4軸在缺血相關炎癥及修復中的作用仍不明了。實驗目的研究CXCR4如何調(diào)控中性粒細胞以及巨噬細胞在缺血下肢處的募集,并探討CXCR4在炎癥細胞的表達對缺血性炎癥反應以及修復的影響。實驗方法：我們通過Cre-LoxP基因敲除技術(shù)得到了髓系細胞(主要是中性粒細胞和巨噬細胞)特異性CXCR4敲除的小鼠(MKO)。我們檢測了MKO小鼠體重,脾臟大小,外周血象等指標,并檢測了中性粒細胞和巨噬細胞表面CXCR4的表達。通過結(jié)扎股動脈我們構(gòu)建了小鼠下肢缺血模型,通過激光多普勒觀察術(shù)后小鼠下肢血流恢復的情況并觀察足趾壞死情況。通過免疫熒光染色我們觀察比較MKO小鼠和對照小鼠缺血組織血管新生的情況,并通過組織化學染色和流式細胞術(shù)觀察炎癥細胞在缺血病灶的浸潤情況,并通過PCR檢測缺血下肢炎癥因子表達情況。在體外,我們觀察SDF-1/CXCR4軸對中性粒細胞,巨噬細胞遷移能力的影響,以及觀察CXCR4敲除對上述兩種細胞促炎能力的影響。為進一步明確CXCR4對巨噬細胞極化的影響,我們分別通過脂多糖(LPS)和干擾素-γ以及白介素-4分別誘導MKO或WT來源的骨髓巨噬細胞向M1型和M2型極化,通過qPCR檢測相關極化標志物的表達水平。實驗結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)MKO小鼠中性粒細胞骨髓中失歸巢,在外周血數(shù)量明顯增加。對照組小鼠較MKO小鼠下肢缺血恢復明顯變差,足趾壞死程度更為嚴重,然而并不影響其遠期預后。提示髓系細胞CXCR4表達對于下肢缺血血流恢復的重要作用。通過免疫熒光染色和流式細胞術(shù)我們發(fā)現(xiàn)較對照小鼠相比,MKO小鼠術(shù)后早期缺血肌肉CDllb陽性細胞和中性粒細胞數(shù)量明顯增加,隨后迅速下降,同時炎癥因子的表達也有所增加。然而巨噬細胞數(shù)量并無明顯改變。在體外試驗,我們發(fā)現(xiàn)CXCR4敲除對于中性粒細胞炎癥因子釋放能力并無影響,明顯增強了巨噬細胞由M0向M1極化的能力兒不改變其向M2極化的能力。同時CXCR4敲除并不影響了中性粒細胞對于SDF-1的遷移能力,而使巨噬細胞遷移能力受損。這些結(jié)果表明髓系細胞SDF-1/CXCR4軸敲除可增強了缺血早中期修復相的炎性反應,而對中后期修復相并無明顯影響。實驗結(jié)論CXCR4是調(diào)節(jié)下肢缺血后炎癥細胞募集的關鍵趨化因子受體,CXCR4缺失可引起急性期過多的中性粒細胞細胞浸潤；同時可通過促進巨噬細胞向M1極化從而加重炎癥反應,然后早期增強的炎癥反應反而增強了缺血早期的血流灌注恢復,提示炎癥在缺血后組織修復中的作用。
[Abstract]:The study of the background of the background of the background is a serious threat to human health, and how to solve the post-ischemic tissue repair and function recovery is the current research hotspot. Inflammation is an essential condition for post-ischemic tissue repair and angiogenesis, and moderate inflammatory response can help to remove necrotic tissue, promote angiogenesis, and excessive inflammatory reaction can aggravate tissue damage and promote further deterioration of ischemic lesions. Chemokines play a critical role in the process of inflammatory cell infiltration. Various chemokines and their receptors have been shown to be involved in the control of the recruitment of post-ischemic inflammatory cells, including the matrix-derived factor (SDF-1) and its ligand CXCR4. And the preliminary studies have shown that the SDF-1/ CXCR4 axis is involved in the regulation of post-ischemic inflammatory response and angiogenesis. However, the role of the SDF-1/ CXCR4 axis in ischemia-related inflammation and repair is still unknown. Objective To study how CXCR4 regulates the recruitment of neutrophils and macrophages at the lower extremity of ischemia, and discusses the effect of CXCR4 on the inflammatory response and repair of inflammatory cells. Methods: We obtained the mouse (MKO) specific to the specific CXCR4 knock-out of the myeloid cells (mainly neutrophils and macrophages) through the Cre-LoxP gene knockout technique. We tested the weight, spleen size and peripheral blood image of MKO mice, and detected the expression of CXCR4 on the surface of neutrophils and macrophages. The lower limb ischemia model of the mice was constructed by ligation of the femoral artery, and the blood flow recovery in the lower extremities of the mice was observed by laser Doppler and the condition of the foot-toe necrosis was observed. In this paper, the expression of the inflammatory cytokines in the ischemic myocardium was detected by immunohistochemistry and flow cytometry, and the expression of the inflammatory factors of the lower limb was detected by PCR. In vitro, we observed the effects of the SDF-1/ CXCR4 axis on the ability of neutrophils and macrophages to migrate and to observe the effects of CXCR4 knockout on the two cell proinflammatory capabilities. In order to further clarify the effects of CXCR4 on the polarization of macrophages, we respectively induced the M-and M2-type polarization of bone marrow macrophages from the source of MKO or WT by lipopolysaccharide (LPS) and interferon-1 and interleukin-4, respectively, and the expression level of the related polarized markers was detected by qPCR. The results showed that the number of peripheral blood in the bone marrow of the MKO mice was significantly increased. In the control group, the lower limb ischemic recovery of the MKP mice was significantly worse, and the degree of toe necrosis was more serious, however, the long-term prognosis of the mice was not affected. It is suggested that the expression of CXCR4 in the myeloid cells plays an important role in the recovery of ischemic blood flow in the lower limbs. Compared with control mice by immunofluorescence staining and flow cytometry, the number of CDl1b positive cells and the number of neutrophils in the early ischemic muscle of the MKO mice increased significantly, and then decreased rapidly, and the expression of the inflammatory factors increased. However, that numb of macrophages did not change significantly. In vitro, we found that CXCR4 knock-out has no effect on the ability to release a neutrophil inflammatory factor, significantly enhancing the ability of macrophages to polarize M1 from M0 to M2 without changing its ability to polarize M2. At the same time, CXCR4 knock-out does not affect the ability of neutrophils to migrate to SDF-1, and the ability to migrate macrophages is impaired. These results suggest that the knock-out of the SDF-1/ CXCR4 shaft of the myeloid cells can enhance the inflammatory reaction of the early-stage repair of the ischemia, and has no significant effect on the phase of the middle and later stage. The results show that CXCR4 is a key chemokine receptor for regulating the recruitment of inflammatory cells after lower limb ischemia. The deletion of CXCR4 can cause excessive neutrophil infiltration in the acute stage, and can increase the inflammatory response by promoting the polarization of the macrophage to the M1. Then the early-enhanced inflammatory reaction enhances the early blood flow perfusion recovery in the early stage of the ischemia, and prompts the inflammation to function in the post-ischemia tissue repair.
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R543

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