發(fā)布時(shí)間：2019-05-11 05:55

【摘要】：動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis, AS)是一組稱為動(dòng)脈硬化的血管病中最常見(jiàn)、最重要的一種,可波及全身動(dòng)脈血管,以大、中動(dòng)脈最常見(jiàn)。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病是動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致器官病變的最常見(jiàn)的類型,已經(jīng)成為全世界致死率位居第一的疾病,遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)惡性腫瘤對(duì)人類的威脅。因此如何有效抑制動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展,預(yù)防冠心病的發(fā)生,已成為亟待解決的問(wèn)題。目前通過(guò)Framingham研究及大型流行病學(xué)調(diào)查,已明確了其諸多冠心病危險(xiǎn)因素,比如吸煙、肥胖、高血壓、高血脂、年齡、糖尿病、靜息生活方式,以及高尿酸血癥、高同型半胱氨酸血癥等。目前,生物鐘紊亂對(duì)冠心病的影響越來(lái)越受重視。研究表明,生物鐘周期異�？赡苤苯佑绊懶穆省⒀獕�、激素水平、自主神經(jīng)功能以及血液成分,導(dǎo)致多種心血管疾病,降低心臟功能,對(duì)健康產(chǎn)生重大危害。代謝綜合征(Metabolic syndrome, MS)是一組以肥胖、高血糖、血脂異常以及高血玉等聚集發(fā)病的臨床癥候群,是多種心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)的危險(xiǎn)因素在同一個(gè)體聚集的病理狀態(tài)。我國(guó)的研究結(jié)果顯示,代謝綜合征患者10年心血管病危險(xiǎn)性較非代謝綜合征增加了1.85倍。正常的生物鐘節(jié)律對(duì)機(jī)體代謝的調(diào)節(jié)有重要的臨床意義,而慢性的生物節(jié)律紊亂,比如倒班工作,與胰島素抵抗、肥胖、代謝綜合征和糖尿病等的高患病率密切相關(guān)。Bmall (brain and muscle Arnt-like protein)基因,又稱為MOP3或ARNT3.是其中的一種生物鐘子鐘基因.是維持生物鐘節(jié)律性振蕩的關(guān)鍵基因。源于染色體免疫共沉淀測(cè)序分析,在小鼠肝臟中,時(shí)間解析的全基因組Bmall結(jié)合圖顯示碳?xì)浠衔锎x是這一生物鐘的主要輸出。骨骼肌是胰島素依賴的血糖處理的主要部位,但肌肉生物鐘在調(diào)節(jié)糖攝入及代謝方面特殊的作用還無(wú)從知道。本研究即是通過(guò)小鼠骨骼肌特異性敲除Bmall研究其對(duì)肌肉本身及整體血糖及脂肪代謝的影響,從而在代謝方面探討生物鐘紊亂引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制。研究表明,吸煙是心血管疾病的主要危險(xiǎn)因子。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,吸煙20min即可損傷冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮,而冠狀動(dòng)脈粥樣硬化病變的早期主要發(fā)生在冠狀動(dòng)脈的內(nèi)皮細(xì)胞。但吸煙對(duì)血管內(nèi)皮損傷的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞作為一個(gè)動(dòng)脈粥樣化形成的病灶,顯示了細(xì)胞粘附分子比如ICAM一1和VCAM一1表達(dá)的增長(zhǎng)。確切的證據(jù)表明在對(duì)于各種刺激的炎癥反應(yīng)中p38絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路(p38MAPK)擔(dān)負(fù)著一個(gè)關(guān)鍵的角色。然而p38MAPK信號(hào)通路在粘附分子在內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)方面的影響還沒(méi)有被探討。本研究即是通過(guò)觀察尼古丁對(duì)小鼠心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM一1和VCAM一1表達(dá)的影響,進(jìn)一步明確吸煙對(duì)冠心病的致病機(jī)理,并探討p38MAPK在細(xì)胞粘附分子表達(dá)中的作用。研究表明,吸煙可以影響HRV及皮質(zhì)醇的分泌節(jié)律,這說(shuō)明吸煙與主物鐘節(jié)律有關(guān),可以通過(guò)影響生物鐘節(jié)律導(dǎo)致體內(nèi)的一系列變化。吸煙亦與代謝綜合征有密切關(guān)系�，F(xiàn)有資料證明,p38MAPK參與了生物鐘基因的表達(dá)及晝夜節(jié)律的輸入和輸出。由此可見(jiàn),生物鐘紊亂、吸煙和代謝綜合征緊密相關(guān),三者可能相互影響起到協(xié)同作用。而p38MAPK可能是其中的關(guān)鍵信號(hào)通路。因此,本研究在分別觀察生物鐘紊亂及吸煙導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的致病機(jī)制的同時(shí),進(jìn)一步探討兩者之間的相互影響及內(nèi)在聯(lián)系,從而闡明其致病原因。第一部分骨骼肌內(nèi)在生物鐘Bmall缺乏對(duì)肌肉本身代謝的影響目的：觀察骨骼肌選擇性敲除Bmall對(duì)肌肉糖脂代謝的影響及相關(guān)基因及酶的改變,并進(jìn)一步探討其機(jī)制。方法：骨骼肌選擇性敲除Bmall小鼠為觀察對(duì)象,Bmal1-/-小鼠(B6.129一Arntl'm1Bra/J)由Jackson實(shí)驗(yàn)室提供,為實(shí)驗(yàn)組,記為KO組(MCK-Cre+/BMfl/fl),控制組為WT組(MCK-Cre-/BMfl/fl).KO組及WT組根據(jù)進(jìn)食狀態(tài)不同又分為禁食組(Fasting組),禁食后飼喂組(Refed組)。每組小鼠5-6只。均給予持續(xù)的12：12光照黑暗循環(huán),光照開(kāi)始時(shí)間于7：00a.m.,記為ZT0。8-12周齡的小鼠被用來(lái)研究。分離生長(zhǎng)10周的WT組和KO組小鼠的后肢肌肉TA.Soleus和GN,肝臟,下丘腦,用qRT-PCR、免疫印跡法、組織免疫熒光法觀察比較以下基因及蛋白的表達(dá)：1、生物鐘基因Bmall.Rev-erbα;2、糖脂代謝相關(guān)基因MCAD、CPT-1b、LPL、FAS.Glut4、PDK4、分別從WT組和KO組生長(zhǎng)4周的小鼠的后肢肌肉分離原代成肌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),用細(xì)胞免疫熒光染色及qRT-PCR觀察比較兩組間細(xì)胞分化情況及肌生成相關(guān)基因Mck、Myf5、Myogenin、MLC1、Myh3的表達(dá)。用核磁共振成像技術(shù)評(píng)估10司時(shí)兩組間肌肉的質(zhì)量。分離生長(zhǎng)10周的WT組和KO組后肢肌肉TA、EDL,測(cè)定TA、EDL的脂肪酸氧化率和葡萄糖氧化率。分離生長(zhǎng)10周的WT組和KO組后肢肌肉TA,行免疫組織化學(xué)熒光染色及免疫印跡,；匕較MyHC IIA和MyHC IIB勺表達(dá)情況。結(jié)果：KO組原代成肌細(xì)胞的分化、各成肌細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)未受影響,總肌肉占體重百分比及單個(gè)肌肉占體重百分比未受影響。在正常小鼠中,禁食后飼喂?fàn)顟B(tài)下Glut4蛋白、Bmall蛋白在比目魚(yú)肌及肝臟中表達(dá)明顯增加；在禁食狀態(tài)下,Rev-erba蛋白和PDK4蛋白在脛前肌及比目魚(yú)肌表達(dá)增加。在禁食后飼喂?fàn)顟B(tài)下,KO組PDK4蛋白表達(dá)水平在TA和Soleus中均顯著增加,Glut4蛋白表達(dá)水平在TA和Soleus中均顯著減少；而在禁食狀態(tài)下,PDK4和Glut4的蛋白表達(dá)水平兩組間未見(jiàn)明顯差異。qRT-PCR分析PDK4、MCAD、CPT-lb也表現(xiàn)出了同樣的趨勢(shì)(P0.05)。KO組骨骼肌的葡萄糖氧化水平減低,而脂肪酸p-氧化水平增加(P0.05)。應(yīng)用qRT-PCR分析了兩組在9AM(ZT2)和5PM(ZT10)時(shí)有關(guān)葡萄糖和脂肪酸代謝基因的在TA中的表達(dá)水平,結(jié)果顯示與脂肪代謝有關(guān)的基因MCAD與CPT-lb在9AM時(shí)KO組表達(dá)明顯增加,而PDK4在9AM及5PM時(shí)均明顯增加。應(yīng)用免疫組織化學(xué)及免疫印跡分析發(fā)現(xiàn),KO組脛前肌(TA)中的肌纖維MyHC IIA曾加,而MyHC IIB減少。第二部分骨骼肌內(nèi)在生物鐘Bmall缺乏對(duì)全身代謝的影響目的：觀察骨骼肌選擇性敲除Bmall對(duì)機(jī)體整體糖脂代謝的影響,并進(jìn)一步探討肥胖形成的機(jī)制。方法：骨骼肌選擇性敲除Bmall小鼠為觀察對(duì)象,Bmall-/-小鼠(B6.129-ArntltmlBra/J)由Jackson實(shí)驗(yàn)室提供,為實(shí)驗(yàn)組,記為KO組(MCK-Cre+/BMfl/fl),控制組為WT組(MCK-Cre-/BMfl/fl)。KO組及WT組根據(jù)進(jìn)食狀態(tài)不同又分為禁食組(Fasting組),禁食后飼喂組(Refed組)。根據(jù)飲食類型KO組及WT組又分為普食飼養(yǎng)組(Chow)及高脂飼養(yǎng)組(HFD)。每組小鼠5-6只。均給予持續(xù)的12：12光照黑暗循環(huán),光照開(kāi)始時(shí)間于7：00a.m.,記為ZT0。8-12周齡的小鼠被用來(lái)研究。取WT組及KO組眼球后靜脈血,比較兩組在Refed:和Fasting狀態(tài)下血清游離脂肪酸(FFA)、甘油(Glycerol)、甘油三酯(Triglyceride)糖(Glucose)、膽固醇(Cholestorel)水平。分離小鼠肝臟,包括Refed和Fasting組、Chow組和HFD組,行肝臟甘油三酯提取測(cè)定含量及油紅O染色,比較在不同條件下WT組和KO組肝臟脂肪含量。比較WT組和KO組在Chow和HFD情況下體重的變化,觀察4-12周。比較WT組和KO組在禁食0、12、24、36小時(shí)時(shí)體內(nèi)脂肪含量的變化。用Comprehensive Lab Animal Monitoring System (CLAMS)則定兩組的呼吸交換率、氧消耗量、總體活動(dòng)水平。結(jié)果：結(jié)果顯示在禁食狀態(tài)下(Fasted), KO組循環(huán)中的游離脂肪酸(FFA)、甘油(Glycerol)和甘油三酯(Triglyceride)水平均明顯降低,分別為P0.01,P0.05,P0.01；而血糖水平顯著升高,P0.01。在禁食后飼喂?fàn)顟B(tài)下(Refed,4hrs)兩組間以上指標(biāo)無(wú)明顯差異。KO組肝臟中的甘油三酯(Triglyceride)含量在禁食狀態(tài)下明顯減少,P0.01。肝臟切片的油紅O染色(oil-red-O staining)圖像顯示,在禁食狀態(tài)下,WT組肝臟脂肪滴明顯增多,而KO組肝臟脂肪滴明顯較少。無(wú)論是普食飼喂組還是高脂飼喂組,在9AM時(shí)KO組肝臟中甘油三酯(TG)含量均明顯減少(P0.01),肝臟切片的油紅O染色也顯示出了同樣的趨勢(shì)。在高脂飼喂組,KO組在12周時(shí)體重明顯減低,P0.01；體脂含量在4周和12周時(shí)均表現(xiàn)出了明顯減低,分別為P0.05,P0.01。發(fā)現(xiàn)在禁食12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)時(shí)KO組體脂的含量均明顯少于WT組,分別為P0.01,P0.05,P0.05。兩組間呼吸交換率、每天的食物攝入量、每小時(shí)的氧消耗量、總體活動(dòng)水平無(wú)明顯差異。第三部分尼古丁經(jīng)由p38 MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)ICAM-1和VCAM-1在小鼠心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)目的：探討吸煙對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性標(biāo)志物ICAM-1和VCAM-1的影響及p38 MAPK信號(hào)通路在其中的作用。方法：分離小鼠的心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),第3至5代細(xì)胞被用來(lái)作為尼古丁暴露。用三種不同濃度的尼古丁進(jìn)行處理,濃度分別為10-5,10-6和10-7M,實(shí)驗(yàn)證明當(dāng)小鼠的心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞暴露在10-6M尼古丁的濃度下8個(gè)小時(shí),ICAM-1和VCAM-1的活性達(dá)到了峰值。我們用10-6M濃度的尼古丁進(jìn)行隨后的實(shí)驗(yàn)。將培養(yǎng)的心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞分兩組,一組用10-6M濃度的尼古丁處理細(xì)胞,另一組用10μM濃度的p38MAPK抑制劑(SB203580)預(yù)處理小鼠的心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞30分鐘,然舌再用10-6M濃度的尼古丁處理細(xì)胞。處理后提取兩組細(xì)胞的RNA及蛋白,用qPCR及免疫印跡法比較兩組ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)。結(jié)果：結(jié)果顯示尼古丁通過(guò)p38絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路增強(qiáng)了細(xì)胞粘附分子ICAM-1和VCAM-1在小鼠心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)。結(jié)論：本研究發(fā)現(xiàn)肌肉Bmall的基因消融導(dǎo)致了代謝向脂肪氧化的方向轉(zhuǎn)移,減少了肌肉對(duì)糖的攝取和利用,引發(fā)了胰島素抵抗,缺少了正常狀態(tài)下能量代謝在休息／空腹?fàn)顟B(tài)下以脂肪代謝為主向活動(dòng)／飼喂?fàn)顟B(tài)下以糖代謝為主轉(zhuǎn)變的這一正常的生理現(xiàn)象,并促使肌纖維的組成類型發(fā)生了相應(yīng)的變化。肌肉中增強(qiáng)的脂肪氧化反過(guò)來(lái)阻止了肝臟中脂質(zhì)的聚集而足進(jìn)了脂肪組織中脂肪的動(dòng)員。由于過(guò)量的甘油供應(yīng)用于肝臟的糖異生而司時(shí)減少了肌肉中糖的利用,導(dǎo)致了循環(huán)中葡萄糖水平的升高而甘油三酯陽(yáng)游離脂肪酸的水平降低,進(jìn)而抑制了高脂飲食導(dǎo)致的肥胖。因此我們可以推斷Bmall功能的增強(qiáng)可能會(huì)造成相反的結(jié)果,即胰島素敏感性增加,從而導(dǎo)致了糖利用增加,抑制了脂肪酸p-氧化,而體內(nèi)脂肪的過(guò)度積累造成了脂肪肝的形成及肥胖。本研究通過(guò)觀察尼古丁對(duì)小鼠心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1和VCAM-1表達(dá)的影響,證明了10-6M的尼古丁在8小時(shí)時(shí)最大程度上增加了ICAM-1和VCAM-1在小鼠心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)。我們的結(jié)果提供了一個(gè)推定的機(jī)制即尼古丁通過(guò)p38絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路刺激了這些粘附分子的表達(dá)。綜上所述,Bmall功能的缺失,將導(dǎo)致胰島素抵抗,升高循環(huán)中血糖的水平,而B(niǎo)mall功能的增強(qiáng)可能會(huì)抑制脂肪的氧化,導(dǎo)致循環(huán)中血脂水平增高及機(jī)體脂肪的蓄積,及無(wú)論Bmall的功能是減低還是增強(qiáng),都可能導(dǎo)致機(jī)體糖脂代謝的異常,從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生；而尼古丁通過(guò)p38MAPK信號(hào)通路刺激了心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子表達(dá)的增加,從而促發(fā)了血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng),導(dǎo)致了動(dòng)脈粥樣硬化。另外,我們推斷生物鐘紊亂、吸煙、代謝綜合征之間可能存在某種聯(lián)系。即吸煙在導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的同時(shí),會(huì)對(duì)機(jī)體的代謝產(chǎn)生影響。而生物鐘紊亂在本研究中已證實(shí)對(duì)代謝產(chǎn)生了確切的影響。在本研究中證實(shí)吸煙可以通過(guò)p38MAPK信號(hào)通路產(chǎn)生不良反應(yīng),而既往研究證實(shí)p38MAPK信號(hào)通路可以對(duì)生物鐘產(chǎn)生影響,所以吸煙可能通過(guò)p38MAPK信號(hào)通路影響生物鐘的表達(dá),進(jìn)而影響機(jī)體的代謝。當(dāng)然這還需要進(jìn)一步的研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R543.5

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本文編號(hào)：2474291