【摘要】：目的:肺動脈高壓是一種復(fù)雜的小肺動脈疾病,以持續(xù)性血管收縮,血管壁的增厚,血管改建和進展性肺動脈阻力的增加為特征,其病情發(fā)展可導(dǎo)致右心衰竭并最終導(dǎo)致死亡。肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cell,PASMC)的異常增殖被認為是血管壁增厚,血管改建,動脈管腔狹窄的主要原因。最近的動物和人的實驗研究均表明,除了缺氧外,吸煙可能對血管結(jié)構(gòu)的變化產(chǎn)生直接的作用,致使發(fā)生肺動脈的改建進而發(fā)展為肺動脈高壓。然而,這其中準(zhǔn)確的機制尚不完全清楚。細胞內(nèi)鈣離子在調(diào)節(jié)血管平滑肌中扮演著重要的作用。細胞內(nèi)鈣離子的增加可以激活收縮蛋白,并引起收縮反應(yīng)。細胞內(nèi)鈣離子濃度的增加主要依賴肌漿網(wǎng)(SR),電壓門控鈣通道(voltage-operated calcium channels,VOCC),和鈣庫操作性鈣通道(store-operated calcium channel,SOCC)。近年來,SOCC 在血管平滑肌領(lǐng)域獲得了極大的研究注意。SOCC是一種高度選擇性的鈣通道,其組分構(gòu)成尚不完全清楚,且因細胞種類不同而異,目前已發(fā)現(xiàn)包括基質(zhì)相互作用分子(stromal interaction molecule,STIM)家族、Orai、一過性受體電位非選擇性陽離子通道(transient receptor potential non-selective cation channel,TRPC)家族。TRPC 是SOCC的重要組成部分,可以被G蛋白偶聯(lián)受體和酪氨酸激酶受體活化,是一種非選擇性、Ca2+滲透性陽離子通道,有證明表明好幾種TRPC通道充當(dāng)SOCC的組成,然而,大部分證據(jù)都依賴于特定TRPC亞型的敲除或者siRNA的轉(zhuǎn)染沉默,而非直接證明其在SOCC的功能。一個重要的研究發(fā)現(xiàn)是,特定亞型的TRPC的敲除可引起同等程度的SOCC活動和鈣內(nèi)流的抑制。一般來說,TRPC1,4和5對鈣庫的耗竭敏感,是SOCC的組成部分,TRPC3,6和7組成受體操作性鈣通道(receptor-operated channels,ROCs),為 G 蛋白激酶 C 和甘油二酯提供門控。STIM家族主要包括兩種亞型,STIM1和STIM2,有實驗證明在HEK293細胞,STIM1被siRNA轉(zhuǎn)染后的表達下調(diào)可抑制毒胡蘿卜素引起的鈣內(nèi)流和毒蕈堿刺激誘導(dǎo)的鈣電流,但是不改變剩余鈣離子水平,膜電位。而STIM2的抑制則沒有STIM1明顯。STIM1氨基端的信號肽序列和跨膜部分表明蛋白的氨基端對應(yīng)著細胞內(nèi)基質(zhì)和ER的管腔,所以STIM1可能充當(dāng)鈣離子感受器的作用,引起SOCE的活動。STIM1以介導(dǎo)非興奮細胞的鈣觸發(fā)鈣釋放電流而作為其主要功能,同時,STIM1也被發(fā)現(xiàn)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上充當(dāng)感受器。在PASMC,SOCC主要由表達于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子感受器STIM1與表達于細胞膜的非選擇性蛋白TRPC1是SOCC的重要組成部分。通過SOCC形成的操作性鈣內(nèi)流(store-operated calcium entry,SOCE),近年來獲得了極大地研究關(guān)注。盡管SOCE被發(fā)現(xiàn)已有20年,但SOCC的構(gòu)成和功能一直存在爭議。SOCE是一種重要的細胞程序,與許多細胞活動相關(guān),如增殖、遷移、收縮等。之前有許多研究證明,不同類型的細胞內(nèi)SOCE的阻斷可抑制細胞增殖,而細胞增殖則與SOCE的增強有關(guān)。SOCE形成的典型細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑如下:當(dāng)胞內(nèi)尤其是肌質(zhì)網(wǎng)儲存的Ca2+的耗竭時,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的跨膜蛋白即鈣離子感受器STIM1聚集成簇并脫離內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合位點,朝細胞膜移動,將成孔蛋白TRPC1活化,并形成STIM1—TRPC1復(fù)合體,導(dǎo)致Ca2+通道開放,進而形成SOCE。SOCE在PASMCs的增殖和遷移中扮演重要角色,SOCE的阻滯劑如Ni2+、SKF96365能明顯減緩PASMC的增殖。細胞周期蛋白D1(cyclin D1)是cyclin家族中的重要成員,是細胞增殖程序重要的調(diào)節(jié)物質(zhì),在細胞增殖過程,cyclin D1可作為絲分裂的感受器,同時也能通過驅(qū)動目的細胞度過G1期以促進細胞增殖。作為一種協(xié)作癌基因,cyclin D1基因在惡性腫瘤患者頻繁過表達,并且在腫瘤的發(fā)展、維持中起著十分重要的作用。有模型表示cyclin D1的過表達在細胞周期調(diào)控途徑中可能充當(dāng)驅(qū)動癌基因的角色。腫瘤生長階段,可較早發(fā)現(xiàn)cyclin D1表達過剩。且近來越來越多的報道指出,cyclin D1是與肺動脈高壓相關(guān)的重要的下游媒介,可通過促進PASMCs增殖的方式參與肺動脈血管的重塑�；谝陨献C據(jù),我們假設(shè)吸煙促進PASMCs增殖的機制為:吸煙誘導(dǎo)PASMC的SOCC表達的上調(diào)(SOCE的增強),接著SOCE的增強引起下游的cyclin D1表達增加來促進細胞增殖。本實驗將就此假設(shè)研究吸煙引起細胞增殖的分子機制。方法:第一部分:研究CSE對HPASMCs增殖的影響。對HPASMCs分別進行0(對照組),0.5%,1%,2%,3%,5%,10%濃度的CSE處理,24小時后觀察HPASMCs的增殖情況。第二部分:研究CSE處理后細胞的STIM1,TRPC1和cyclin D1的mRNA和蛋白表達水平,以及鈣離子濃度。根據(jù)第一部分的實驗結(jié)果,將HPASMCs分成4組即0(對照組)、0.5%CSE組、11%CS組、33%CS組,并分別應(yīng)應(yīng)用western blot和RT-PCR檢測各組細胞的STIM1,TRPC1和cyclin D1的mRNA和蛋白表達水平,為更直觀地觀察各組細胞內(nèi)鈣離子濃度,使用鈣探針對各組細胞內(nèi)鈣離子濃度進行檢測。第三部分:研究SOCC與cyclin D1的關(guān)系。對HPASMCs進行siRNA(TRPC1)轉(zhuǎn)染和陰性對照轉(zhuǎn)染,再對兩類HPASMCs各4組的細胞增殖情況和cyclin D1 mRNA和蛋白表達水平進行檢測。結(jié)果:第一部分:0.5%,1%CSE組對HPASMCs有促進增殖作用(P0.05),且0.5%CSE組促進作用更加明顯(P0.05),而3%及以上濃度的CSE對HPASMCs反而有抑制作用(P0.05)。第二部分:與對照組相比,0.5%,1%CSE組的STIM1,TRPC1,cyclin D1的mRNA和蛋白表達水平,以及細胞內(nèi)鈣離子濃度都有升高(P0.05)。而3%CSE組的STIM1,TRPC1,cyclin D1的mRNA和蛋白表達水平和細胞內(nèi)鈣離子濃度則出現(xiàn)下降(P0.05)。第三部分:siRNA(TRPC1)轉(zhuǎn)染組的HPASMCs增殖和cyclinD1 mRNA和蛋白表達水平均較陰性對照組降低(P0.05)。結(jié)論:第一部分:低濃度的CSE可以促進HPASMCs增殖,而高濃度的CSE則抑制HPASMCs 增殖。第二部分:CSE通過SOCE的增強(SOCC的上調(diào))以促進HPASMCs增殖。第三部分:CSE通過(至少是部分)SOCC的介導(dǎo)的cyclin D1表達通路誘導(dǎo)HPASMCs 增殖。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R544.1

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本文編號：2446943