【摘要】：目的:肺動脈高壓是一種復雜的小肺動脈疾病,以持續(xù)性血管收縮,血管壁的增厚,血管改建和進展性肺動脈阻力的增加為特征,其病情發(fā)展可導致右心衰竭并最終導致死亡。肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cell,PASMC)的異常增殖被認為是血管壁增厚,血管改建,動脈管腔狹窄的主要原因。最近的動物和人的實驗研究均表明,除了缺氧外,吸煙可能對血管結構的變化產(chǎn)生直接的作用,致使發(fā)生肺動脈的改建進而發(fā)展為肺動脈高壓。然而,這其中準確的機制尚不完全清楚。細胞內鈣離子在調節(jié)血管平滑肌中扮演著重要的作用。細胞內鈣離子的增加可以激活收縮蛋白,并引起收縮反應。細胞內鈣離子濃度的增加主要依賴肌漿網(wǎng)(SR),電壓門控鈣通道(voltage-operated calcium channels,VOCC),和鈣庫操作性鈣通道(store-operated calcium channel,SOCC)。近年來,SOCC 在血管平滑肌領域獲得了極大的研究注意。SOCC是一種高度選擇性的鈣通道,其組分構成尚不完全清楚,且因細胞種類不同而異,目前已發(fā)現(xiàn)包括基質相互作用分子(stromal interaction molecule,STIM)家族、Orai、一過性受體電位非選擇性陽離子通道(transient receptor potential non-selective cation channel,TRPC)家族。TRPC 是SOCC的重要組成部分,可以被G蛋白偶聯(lián)受體和酪氨酸激酶受體活化,是一種非選擇性、Ca2+滲透性陽離子通道,有證明表明好幾種TRPC通道充當SOCC的組成,然而,大部分證據(jù)都依賴于特定TRPC亞型的敲除或者siRNA的轉染沉默,而非直接證明其在SOCC的功能。一個重要的研究發(fā)現(xiàn)是,特定亞型的TRPC的敲除可引起同等程度的SOCC活動和鈣內流的抑制。一般來說,TRPC1,4和5對鈣庫的耗竭敏感,是SOCC的組成部分,TRPC3,6和7組成受體操作性鈣通道(receptor-operated channels,ROCs),為 G 蛋白激酶 C 和甘油二酯提供門控。STIM家族主要包括兩種亞型,STIM1和STIM2,有實驗證明在HEK293細胞,STIM1被siRNA轉染后的表達下調可抑制毒胡蘿卜素引起的鈣內流和毒蕈堿刺激誘導的鈣電流,但是不改變剩余鈣離子水平,膜電位。而STIM2的抑制則沒有STIM1明顯。STIM1氨基端的信號肽序列和跨膜部分表明蛋白的氨基端對應著細胞內基質和ER的管腔,所以STIM1可能充當鈣離子感受器的作用,引起SOCE的活動。STIM1以介導非興奮細胞的鈣觸發(fā)鈣釋放電流而作為其主要功能,同時,STIM1也被發(fā)現(xiàn)在內質網(wǎng)膜上充當感受器。在PASMC,SOCC主要由表達于內質網(wǎng)的鈣離子感受器STIM1與表達于細胞膜的非選擇性蛋白TRPC1是SOCC的重要組成部分。通過SOCC形成的操作性鈣內流(store-operated calcium entry,SOCE),近年來獲得了極大地研究關注。盡管SOCE被發(fā)現(xiàn)已有20年,但SOCC的構成和功能一直存在爭議。SOCE是一種重要的細胞程序,與許多細胞活動相關,如增殖、遷移、收縮等。之前有許多研究證明,不同類型的細胞內SOCE的阻斷可抑制細胞增殖,而細胞增殖則與SOCE的增強有關。SOCE形成的典型細胞內信號轉導途徑如下:當胞內尤其是肌質網(wǎng)儲存的Ca2+的耗竭時,內質網(wǎng)上的跨膜蛋白即鈣離子感受器STIM1聚集成簇并脫離內質網(wǎng)結合位點,朝細胞膜移動,將成孔蛋白TRPC1活化,并形成STIM1—TRPC1復合體,導致Ca2+通道開放,進而形成SOCE。SOCE在PASMCs的增殖和遷移中扮演重要角色,SOCE的阻滯劑如Ni2+、SKF96365能明顯減緩PASMC的增殖。細胞周期蛋白D1(cyclin D1)是cyclin家族中的重要成員,是細胞增殖程序重要的調節(jié)物質,在細胞增殖過程,cyclin D1可作為絲分裂的感受器,同時也能通過驅動目的細胞度過G1期以促進細胞增殖。作為一種協(xié)作癌基因,cyclin D1基因在惡性腫瘤患者頻繁過表達,并且在腫瘤的發(fā)展、維持中起著十分重要的作用。有模型表示cyclin D1的過表達在細胞周期調控途徑中可能充當驅動癌基因的角色。腫瘤生長階段,可較早發(fā)現(xiàn)cyclin D1表達過剩。且近來越來越多的報道指出,cyclin D1是與肺動脈高壓相關的重要的下游媒介,可通過促進PASMCs增殖的方式參與肺動脈血管的重塑�；谝陨献C據(jù),我們假設吸煙促進PASMCs增殖的機制為:吸煙誘導PASMC的SOCC表達的上調(SOCE的增強),接著SOCE的增強引起下游的cyclin D1表達增加來促進細胞增殖。本實驗將就此假設研究吸煙引起細胞增殖的分子機制。方法:第一部分:研究CSE對HPASMCs增殖的影響。對HPASMCs分別進行0(對照組),0.5%,1%,2%,3%,5%,10%濃度的CSE處理,24小時后觀察HPASMCs的增殖情況。第二部分:研究CSE處理后細胞的STIM1,TRPC1和cyclin D1的mRNA和蛋白表達水平,以及鈣離子濃度。根據(jù)第一部分的實驗結果,將HPASMCs分成4組即0(對照組)、0.5%CSE組、11%CS組、33%CS組,并分別應應用western blot和RT-PCR檢測各組細胞的STIM1,TRPC1和cyclin D1的mRNA和蛋白表達水平,為更直觀地觀察各組細胞內鈣離子濃度,使用鈣探針對各組細胞內鈣離子濃度進行檢測。第三部分:研究SOCC與cyclin D1的關系。對HPASMCs進行siRNA(TRPC1)轉染和陰性對照轉染,再對兩類HPASMCs各4組的細胞增殖情況和cyclin D1 mRNA和蛋白表達水平進行檢測。結果:第一部分:0.5%,1%CSE組對HPASMCs有促進增殖作用(P0.05),且0.5%CSE組促進作用更加明顯(P0.05),而3%及以上濃度的CSE對HPASMCs反而有抑制作用(P0.05)。第二部分:與對照組相比,0.5%,1%CSE組的STIM1,TRPC1,cyclin D1的mRNA和蛋白表達水平,以及細胞內鈣離子濃度都有升高(P0.05)。而3%CSE組的STIM1,TRPC1,cyclin D1的mRNA和蛋白表達水平和細胞內鈣離子濃度則出現(xiàn)下降(P0.05)。第三部分:siRNA(TRPC1)轉染組的HPASMCs增殖和cyclinD1 mRNA和蛋白表達水平均較陰性對照組降低(P0.05)。結論:第一部分:低濃度的CSE可以促進HPASMCs增殖,而高濃度的CSE則抑制HPASMCs 增殖。第二部分:CSE通過SOCE的增強(SOCC的上調)以促進HPASMCs增殖。第三部分:CSE通過(至少是部分)SOCC的介導的cyclin D1表達通路誘導HPASMCs 增殖。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R544.1

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