【摘要】：研究背景人體內(nèi)尿酸(Uric acid, UA)是嘌呤代謝的終產(chǎn)物,是人體血液中重要的緩沖鹽,人類因尿酸酶基因突變失活,尿酸不能繼續(xù)降解而使血尿酸水平較其它哺乳動物高。以往研究認(rèn)為尿酸是一種抗氧化物質(zhì),對心臟、血管及神經(jīng)細(xì)胞等起到一定的保護作用,然而近年來對于尿酸的認(rèn)識正在發(fā)生著顛覆性的變化。目前研究發(fā)現(xiàn),高濃度尿酸不僅失去其抗氧化的保護作用,反而可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的發(fā)生,從而導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞、胰島細(xì)胞、肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞損傷及功能障礙。臨床研究也證實高尿酸血癥與高脂血癥、糖尿病、肥胖等危險因素一樣,是導(dǎo)致急性心肌梗塞(AMI)、心衰、高血壓等多種心血管疾病(CVD)的獨立危險因素,利用黃嘌呤氧化酶(XO)抑制劑來降低血漿尿酸水平的治療能改善內(nèi)皮細(xì)胞功能、降低胰島素抵抗及系統(tǒng)性炎癥,從而使合并心血管疾病的患者及無癥狀的高尿酸血癥患者受益研究表明尿酸可以誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞、胰島細(xì)胞、肝細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞凋亡增加及增殖下降,但在不同細(xì)胞中,引起細(xì)胞損傷所需的尿酸濃度不盡相同。2014年美國風(fēng)濕病協(xié)會建議：目標(biāo)血清UA水平為6mg/dl,合并其他危險因素的患者或嚴(yán)重痛風(fēng)患者目標(biāo)血清UA水平應(yīng)低于6mg/dl,但在我們的臨床工作中對無癥狀高尿酸血癥的早期干預(yù)的重視嚴(yán)重不足。其原因一方面由于臨床上血尿酸水平的升高往往是無癥狀的,多是在查體時發(fā)現(xiàn),或者伴發(fā)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性腎病時才被診斷；另一方面,是由于低濃度尿酸對細(xì)胞無損傷作用,可能還具有一定的保護作用,高濃度尿酸才會導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷,對造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷的尿酸濃度的閾值尚無定論。因此,在本研究中我們利用體外培養(yǎng)的原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞建立尿酸損傷模型,觀察不同濃度尿酸對體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡及NO生成能力的影響,為高尿酸血癥的早期臨床干預(yù)提供可借鑒的理論依據(jù)。研究目的1.體外原代培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,建立尿酸損傷的細(xì)胞模型。2.驗證不同濃度尿酸對體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響,篩選出能夠?qū)е聝?nèi)皮細(xì)胞損傷的尿酸濃度。研究方法1.細(xì)胞培養(yǎng)原代培養(yǎng)的HUVECs購自德國PromoCell公司,采用內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基(EGM)進行傳代培養(yǎng),每日相差倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況,選取生長良好的的3-5代細(xì)胞用于實驗。2.細(xì)胞鑒定將HUVEC傳代至激光共聚焦專用培養(yǎng)皿,24h后免疫熒光染色及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記物Von Willebrand factor(vWF).CD31及Smooth muscle alpha-actin(α-SMA)、的表達(dá),對原代培養(yǎng)細(xì)胞進行鑒定。3.細(xì)胞增殖檢測將HUVEC傳代至96孔板,24h后更換含有不同濃度尿酸的培養(yǎng)液(Omg/dl、4mg/m1、6mg/ml、9mg/m1、12mg/m1),誘導(dǎo)12h、24h及48h時,MTT法檢測細(xì)胞增殖情況。4.細(xì)胞凋亡檢測將HUVEC傳代至6孔板,24h后更換含有不同濃度尿酸的培養(yǎng)液(4mg/ml、6mg/ml、9mg/m1.12mg/m1),分別在尿酸誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后12h、24h及48h收集細(xì)胞,利用Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒對細(xì)胞進行染色,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。5.NO含量檢測將HUVEC傳代至6孔板,24h后更換含有不同濃度尿酸的培養(yǎng)液(4mg/ml、6mg/ml、9mg/ml、12mg/ml),分別在尿酸誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后12h、24h及48h收集細(xì)胞培養(yǎng)的上清液,硝酸還原酶法測定細(xì)胞培養(yǎng)液上清中NO的含量。6.統(tǒng)計學(xué)分析本文實驗數(shù)據(jù)均以mean±S D表示。采用SPSS 19.0軟件行One-way ANOVA分析,組間兩兩比較采用SNK-q test分析,以P0.05作為差異有顯著意義,P0.01作為差異有高度顯著性意義。研究結(jié)果1.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的體外原代培養(yǎng)及鑒定體外原代培養(yǎng)的HUVEC形態(tài)不規(guī)則、扁平、呈橢圓形、梭形或多角形,細(xì)胞單層融合時呈典型“鋪路石”樣外觀,體外傳代至第6代時細(xì)胞形態(tài)及生長規(guī)律未見明顯變化。免疫熒光染色及流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果均顯示原代培養(yǎng)的HUVECs中內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物vWF及CD31表達(dá)陽性,成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA表達(dá)陰性,符合內(nèi)皮細(xì)胞特征。2.不同濃度尿酸對細(xì)胞增殖的影響MTT結(jié)果顯示,與對照組比較,4mg/d1及6mg/d1尿酸刺激后12h、24h及48h細(xì)胞增殖均未見明顯變化,9mg/d1尿酸刺激48h出現(xiàn)細(xì)胞增殖能力下降,12mg/d1尿酸刺激24h開始出現(xiàn)細(xì)胞增殖能力下降。3.不同濃度尿酸對細(xì)胞凋亡的影響凋亡檢測結(jié)果顯示,與對照組比較,4mg/d1尿酸刺激12h、24h及48h細(xì)胞凋亡均未見明顯變化,6m/d1尿酸刺激48h細(xì)胞凋亡增加,9mg/d1尿酸刺激24h開始出現(xiàn)細(xì)胞凋亡增加,12mg/d1尿酸刺激12h即出現(xiàn)細(xì)胞凋亡增加,且呈時間依賴性增加。4.不同濃度尿酸對細(xì)胞NO生成能力的影響NO檢測結(jié)果顯示,與對照組比較,4mg/d1尿酸刺激后各個時間點細(xì)胞上清液中NO含量均未見明顯變化,6mg/d1尿酸刺激48h細(xì)胞上清液中NO含量減少,9mg/d1及12mg/d1尿酸刺激后12h均開始出現(xiàn)細(xì)胞上清液中NO含量減少,且呈時間依賴性減少。結(jié)論1.在體外培養(yǎng)的原代HUVEC中,4mg/d1尿酸對細(xì)胞凋亡及增殖無明顯影響。2.濃度高于6mg/d1時尿酸可呈濃度及時間依賴性的誘導(dǎo)凋亡并抑制HUVEC增殖。3.濃度高于6mg/d1時尿酸呈濃度及時間依賴性的誘導(dǎo)HUVEC NO生成減少,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。研究背景內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ),而血管內(nèi)皮功能障礙最突出的表現(xiàn)是NO含量的減少和生物活性的降低。研究顯示高尿酸可使內(nèi)皮細(xì)胞中ROS含量迅速增加,eNOS活性下降,NO釋放減少,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的發(fā)生,然而其作用機制并未闡明。在高尿酸大鼠模型中,大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞泡沫樣水腫,部分內(nèi)皮細(xì)胞從血管壁上脫落,細(xì)胞間隙擴大,管壁處炎細(xì)胞聚集,管壁增厚。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是一種在進化上高度保守的細(xì)胞反應(yīng)機制,缺氧、氧化應(yīng)激反應(yīng)等均可觸發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。適度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有利于增強處理未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白的能力,促進鈣穩(wěn)態(tài)的恢復(fù),持續(xù)而嚴(yán)重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可明顯上調(diào)CHOP和ATF-6表達(dá),誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑的細(xì)胞凋亡,并可通過激活PKC.AKT等信號通路影響細(xì)胞活性及誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)高UA導(dǎo)致腎小球系膜細(xì)胞、肝細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激并觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。在內(nèi)皮細(xì)胞中,同型半胱氨酸硫內(nèi)酯、尿素、ox-LDL等多種刺激因素均通過誘發(fā)氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙,高尿酸導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng),是否會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑的細(xì)胞凋亡及功能障礙目前尚未見有報道。研究目的1.觀察高濃度尿酸誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)ROS含量、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物的表達(dá),探討氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在尿酸誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用。2.檢測高濃度尿酸誘導(dǎo)后NO生成相關(guān)因子及信號通路的表達(dá)變化,并探討高尿酸導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的機制。研究方法1.尿酸誘導(dǎo)及藥物預(yù)處理體外原代培養(yǎng)的HUVECs接種培養(yǎng)板后24h,更換含有尿酸的EGM,分別置入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)不同時間。進行藥理學(xué)干預(yù)時,在尿酸誘導(dǎo)前分別給予氧清除劑PEG-SOD(100 U/ml)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激緩解劑4PBA(10 mM)及PKC抑制劑polymyxin B(20μg/ml)預(yù)處理30min,在尿酸誘導(dǎo)后不同時間分別收集細(xì)胞。2.細(xì)胞內(nèi)ROS含量的檢測體外原代培養(yǎng)的HUVECs接種培養(yǎng)板后24h,更換含有12mg/dl尿酸的EGM,分別置入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)3h、6h、12h、24h,利用特異性CM-H2DCFDA探針檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量。3.Western blotting檢測HUVECs接種培養(yǎng)板后24h,更換含有12mg/d1尿酸的EGM,分別在培養(yǎng)3h、6h、12h、24h時收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,western blotting檢測CHOP、ATF-6、Caspase-12、eNOS、PKC蛋白表達(dá),及eNOS、PKC的磷酸化水平。4.免疫沉淀法檢測eNOS/CaM的相互作用HUVECs接種培養(yǎng)板后24h,更換含有12mg/d1尿酸的EGM,分別在培養(yǎng)3h、6h、12h、24h時收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,利用eNOS抗體與抗原結(jié)合,并與protein A瓊脂糖珠耦聯(lián)后沉淀的原理,使eNOS及與之結(jié)合的蛋白共同沉淀,聯(lián)合western blotting可以檢測出與eNOS結(jié)合的CaM蛋白含量,間接反應(yīng)eNOS/CaM的相互作用。5.胞漿鈣離子濃度檢測HUVECs接種培養(yǎng)板,尿酸誘導(dǎo)3h.6h.12h.24h時,采用鈣離子特異性熒光探針Fluo-3 AM染色,熒光顯微鏡下觀察胞漿內(nèi)鈣離子濃度變化。6.eNOS活性及NO生成的檢測尿酸誘導(dǎo)前分別給予活性氧清除劑PEG-SOD,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激緩解劑4PBA,PKC抑制劑polymyxin B預(yù)處理,尿酸誘導(dǎo)48h收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)的上清液,對細(xì)胞內(nèi)eNOS活性及細(xì)胞上清液中NO含量進行檢測。7.統(tǒng)計學(xué)分析本文實驗數(shù)據(jù)均以mean±SD表示。采用SPSS19.0軟件行One-way ANOVA分析,組間兩兩比較采用SNK-qtest分析,以P0.05作為差異有顯著意義,P0.01作為差異有高度顯著性意義。研究結(jié)果1.高濃度尿酸對細(xì)胞內(nèi)ROS生成的影響與對照組比較,高濃度尿酸(12mg/d1)刺激后3h開始檢測到細(xì)胞內(nèi)ROS生成增多,在12h達(dá)到高峰,24h時持續(xù)高表達(dá)。100U/ml PEG-SOD預(yù)處理能有效抑制尿酸導(dǎo)致的ROS生成增加。2.高濃度尿酸對細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響結(jié)果顯示,與對照組比較,尿酸誘導(dǎo)后6h開始檢測到細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物ATF-6、CHOP表達(dá)增加,在12h達(dá)到高峰；12h開始檢測到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑凋亡因子caspase-12表達(dá)增加,24h達(dá)到高峰。PEG-SOD(100U/ml)及4PBA(10 mM)均能有效抑制UA誘導(dǎo)的ATF6、CHOP及caspase-12表達(dá)增加。3.氧清除劑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑拮抗尿酸導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡及NO生成減少結(jié)果顯示,與對照組比較,UA(12mg/d1)刺激48h后,細(xì)胞凋亡明顯增加、NO生成明顯減少；抗氧化劑PEG-SOD(100U/ml)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4PBA(10 mM)均可有效抑制UA導(dǎo)致的凋亡增加及NO生成減少4.尿酸通過增加Thr495位點的磷酸化降低eNOS活性尿酸刺激后各個時間點,細(xì)胞內(nèi)CaM蛋白表達(dá)量、胞漿鈣離子濃度、eNOS總蛋白表達(dá)量均未見明顯改變。進一步對eNOS的磷酸化水平進行檢測,結(jié)果顯示尿酸刺激后eNOS-Ser1177位點的磷酸化水平無明顯變化,eNOS-Thr495位點的磷酸化水平明顯增加。免疫沉淀結(jié)果顯示,尿酸刺激后與eNOS結(jié)合的CaM明顯減少,提示eNOS/CaM的相互作用減弱。5.尿酸通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激/PKC信號通路降低eNOS活性結(jié)果顯示：PKC總蛋白含量在尿酸刺激后6h,12h及24h均無明顯變化,p-PKC蛋白含量在尿酸刺激6h開始增加,12h達(dá)到高峰；PEG-SOD.4PBA預(yù)處理可有效抑制UA誘導(dǎo)的PKC磷酸化增加。PEG-SOD.4PBA polymyxin B均能夠抑制UA誘導(dǎo)的eNOS Thr495位點的磷酸化水平增加及eNOS活性下降。結(jié)論1.高尿酸可誘導(dǎo)HUVEC發(fā)生氧化應(yīng)激,并啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生,誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑的細(xì)胞凋亡。2.高尿酸誘導(dǎo)后HUVEC內(nèi)eNOS在Thr495位點磷酸化增加,降低eNOS與CaM的相互作用,導(dǎo)致eNOS活性下降,NO釋放減少。3.高尿酸誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過激活PKC信號通路調(diào)控eNOS活性4.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑能夠有效拮抗高尿酸誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R54

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李鵬;周長勇;尹磊;孟憲琴;張麗娜;;低氧對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞活性和內(nèi)皮分化能力的影響及VEGF的干預(yù)作用(英文)[J];中南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2013年04期

，

本文編號：2446208