【摘要】：研究背景：動脈粥樣硬化是由免疫調控和脂質代謝異常共同作用引起的一種慢性炎癥性疾病,是冠心病的主要病理基礎。血管內皮是介于循環(huán)血壓與血管平滑肌之間的生理屏障,內皮細胞在不同刺激作用下,通過分泌多種血管活性因子來平衡血管的舒張和收縮,同時維持血管穩(wěn)態(tài)。當內皮細胞受損時,舒縮平衡被打破,出現(xiàn)功能障礙,破壞血穩(wěn)態(tài),導致白細胞和血小板黏附謄血栓形成、平滑肌細胞增殖、脂質積累和血管痙攣,并最終形成粥樣斑塊。內皮功能障礙是動脈粥樣硬化發(fā)生過程中的主要早期事件,并參與粥樣斑塊的進展和并發(fā)癥的發(fā)生。因而早期預防和控制內皮功能障礙是防治冠心病的關鍵。高同型半胱氨酸血癥是公認的動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的一個獨立危險因素。血漿同型半胱氨酸(homocysteine, Hey)升高會損傷內皮細胞功能,導致內皮依賴的血管舒張功能異常,內皮細胞抗血栓作用喪失,引起脂質過氧化,血小板黏附聚集等一系列病理過程,進而引發(fā)早期動脈粥樣硬化。熱休克蛋白27(heat shock protein 27, HSP27)是小熱休克蛋白(small heat shock proteins, sHSPs)家族中的一員,參與多種細胞過程,如細胞凋亡、炎癥、細胞遷移和動脈壁的穩(wěn)態(tài)維持。研究發(fā)現(xiàn)HSP27在抗心肌凋亡、抗缺血損傷、抗炎性反應中都有積極的作用,對平滑肌細胞的增殖遷移有調控作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)HSP27在動脈粥樣硬化的發(fā)展中起重要作用,血清HSP27水平與動脈粥樣硬化程度呈負相關。目前認為,HSP27可能通過維持血管穩(wěn)態(tài)、抗凋亡、穩(wěn)定細胞骨架、 抑制單核/巨噬細胞介導的細胞受損、穩(wěn)定纖維蛋白血凝塊等發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用。HSP27可能成為動脈粥樣硬化的潛在生物學標志,作為預防和診療動脈粥樣硬化的新靶點。第一部分同型半胱氨酸損傷內皮細胞的機制目的：血漿Hcy升高可導致內皮功能障礙,是動脈粥樣硬化的發(fā)病機制中的早期事件。研究表明Hcy能激活線粒體途徑,誘導血管內皮細胞凋亡。死亡相關蛋白激酶(death-associated protein kinase, DAPK)是一種已知的凋亡調節(jié)基因,可被各種刺激因素激活,是凋亡信號的匯合點。已證實DAPK參與剪切應力誘導的內皮細胞凋亡過程。本實驗擬通過體外細胞實驗觀察Hcy誘導的內皮細胞凋亡,并探討DAPK在其中的調控作用。方法：1.MTT法檢測Hcy對HUVECs細胞生存率的影響；Hoechst33342核染色；AnnexinV-PI雙染及流式細胞術檢測細胞凋亡率。2. qRT-PCR和 Western blot檢測Hcy作用下HUVECs中DAP K表達變化。3.轉染DAPK siRNA抑制HUVECs中DAPK的表達,并應用、Western blot檢驗表達變化；4.流式細胞術檢測DAPK對細胞凋亡率的影響；流式細胞術檢測DAPK對線粒體膜電勢的影響；5. Western blot檢測線粒體凋亡途徑相關蛋白Bax、Bcl-2？ caspase-3及PARP的變化。結果：1.Hcy能降低UVECs的細胞生存率并誘導其凋亡,并呈濃度依賴性;2.Hcy能上調HUVECs中DAPK的表達,并呈濃度依賴；3.轉染DAPK siRNA能明顯下調HUVECs中 DAPK的表達；4.下調DAPK表達能抑制Hcy誘導的細胞凋亡；5.下調DAPK表達能改善線粒體膜電勢,增加Bcl-2蛋白的表達,降低Bax表達,減少caspase-3和PARP裂解。第二部分HSP27對Hcy誘導的內皮細胞損傷的保護作用及其機制目的：血漿Hcy升高可導致內皮功能障礙,被認為是動脈粥樣硬化的獨立危險因素。HSP27是sHSPs家族的重要成員,近來研究報道HSP27有抗動脈粥樣硬化作用。本實驗旨在探討HSP27在Hcy引起的內皮細胞損傷中的保護作用及相關機制。方法：1. Western blot檢測Hcy作用下HUVECs中HSP27基因表達變化；2.構建高表達HSP27的HUVECs細胞系,應用熒光顯微鏡、qRT-PCR和Western blot鑒定HSP27高表達效果；3.亞硝酸還原法檢測細胞培養(yǎng)液中NO水平的變化；qRT-PC R檢測內皮細胞相關細胞因子的r iRNA表達變化；4. AnnexinV-PI染色及流式細胞術檢測高表達HSP27對細胞凋亡的影響；5. Western blot檢測高表達HSP27對Hcy處理的HUVECs中DAPK表達的影響；6.流式細胞術檢測高表達HSP27對ROS水平和線粒體膜電勢的影響；7. Western b lot檢測高表達HSP27對線粒體凋亡相關蛋白Bcl-2、 Bax、caspase-3及 PARP表達的影響。結果：1.Hcy上調HUVECs中 HSP27的表達,并呈劑量依賴性。2.高表達HSP27的HUVECs細胞系能穩(wěn)定高表達HSP27。3. HSP27能減弱Hcy對內皮細胞表達NO和細胞因子的影響。4.HSP27能抑制Hcy引起的內皮細胞凋亡。5.高表達HSP27不影響DAPK的表達變化。6.HSP27能減弱Hcy誘導的ROS產(chǎn)生和MMP喪失。7.HSP27能促進Bcl-2蛋白表達,抑制Bax活化,抑制caspase-3和PARP活化。結論：1.Hcy通過上調DAPK的表達,進而影響B(tài)cl-2/Bax的比率、活化caspase-3介導內皮細胞損傷。2.HSP27可能通過調節(jié)ROS水平和DAPK下游的線粒體凋亡途徑來抑制Hcy誘導的內皮細胞凋亡,從而發(fā)揮保護內皮細胞的作用。
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【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R543.5

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本文編號：2441120