【摘要】：研究背景：動(dòng)脈粥樣硬化是由免疫調(diào)控和脂質(zhì)代謝異常共同作用引起的一種慢性炎癥性疾病,是冠心病的主要病理基礎(chǔ)。血管內(nèi)皮是介于循環(huán)血壓與血管平滑肌之間的生理屏障,內(nèi)皮細(xì)胞在不同刺激作用下,通過分泌多種血管活性因子來平衡血管的舒張和收縮,同時(shí)維持血管穩(wěn)態(tài)。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受損時(shí),舒縮平衡被打破,出現(xiàn)功能障礙,破壞血穩(wěn)態(tài),導(dǎo)致白細(xì)胞和血小板黏附謄血栓形成、平滑肌細(xì)胞增殖、脂質(zhì)積累和血管痙攣,并最終形成粥樣斑塊。內(nèi)皮功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生過程中的主要早期事件,并參與粥樣斑塊的進(jìn)展和并發(fā)癥的發(fā)生。因而早期預(yù)防和控制內(nèi)皮功能障礙是防治冠心病的關(guān)鍵。高同型半胱氨酸血癥是公認(rèn)的動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。血漿同型半胱氨酸(homocysteine, Hey)升高會(huì)損傷內(nèi)皮細(xì)胞功能,導(dǎo)致內(nèi)皮依賴的血管舒張功能異常,內(nèi)皮細(xì)胞抗血栓作用喪失,引起脂質(zhì)過氧化,血小板黏附聚集等一系列病理過程,進(jìn)而引發(fā)早期動(dòng)脈粥樣硬化。熱休克蛋白27(heat shock protein 27, HSP27)是小熱休克蛋白(small heat shock proteins, sHSPs)家族中的一員,參與多種細(xì)胞過程,如細(xì)胞凋亡、炎癥、細(xì)胞遷移和動(dòng)脈壁的穩(wěn)態(tài)維持。研究發(fā)現(xiàn)HSP27在抗心肌凋亡、抗缺血損傷、抗炎性反應(yīng)中都有積極的作用,對(duì)平滑肌細(xì)胞的增殖遷移有調(diào)控作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)HSP27在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展中起重要作用,血清HSP27水平與動(dòng)脈粥樣硬化程度呈負(fù)相關(guān)。目前認(rèn)為,HSP27可能通過維持血管穩(wěn)態(tài)、抗凋亡、穩(wěn)定細(xì)胞骨架、 抑制單核/巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞受損、穩(wěn)定纖維蛋白血凝塊等發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。HSP27可能成為動(dòng)脈粥樣硬化的潛在生物學(xué)標(biāo)志,作為預(yù)防和診療動(dòng)脈粥樣硬化的新靶點(diǎn)。第一部分同型半胱氨酸損傷內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)制目的：血漿Hcy升高可導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙,是動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制中的早期事件。研究表明Hcy能激活線粒體途徑,誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。死亡相關(guān)蛋白激酶(death-associated protein kinase, DAPK)是一種已知的凋亡調(diào)節(jié)基因,可被各種刺激因素激活,是凋亡信號(hào)的匯合點(diǎn)。已證實(shí)DAPK參與剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程。本實(shí)驗(yàn)擬通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察Hcy誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,并探討DAPK在其中的調(diào)控作用。方法：1.MTT法檢測Hcy對(duì)HUVECs細(xì)胞生存率的影響；Hoechst33342核染色；AnnexinV-PI雙染及流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。2. qRT-PCR和 Western blot檢測Hcy作用下HUVECs中DAP K表達(dá)變化。3.轉(zhuǎn)染DAPK siRNA抑制HUVECs中DAPK的表達(dá),并應(yīng)用、Western blot檢驗(yàn)表達(dá)變化；4.流式細(xì)胞術(shù)檢測DAPK對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測DAPK對(duì)線粒體膜電勢的影響；5. Western blot檢測線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2？ caspase-3及PARP的變化。結(jié)果：1.Hcy能降低UVECs的細(xì)胞生存率并誘導(dǎo)其凋亡,并呈濃度依賴性;2.Hcy能上調(diào)HUVECs中DAPK的表達(dá),并呈濃度依賴；3.轉(zhuǎn)染DAPK siRNA能明顯下調(diào)HUVECs中 DAPK的表達(dá)；4.下調(diào)DAPK表達(dá)能抑制Hcy誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；5.下調(diào)DAPK表達(dá)能改善線粒體膜電勢,增加Bcl-2蛋白的表達(dá),降低Bax表達(dá),減少caspase-3和PARP裂解。第二部分HSP27對(duì)Hcy誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制目的：血漿Hcy升高可導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙,被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。HSP27是sHSPs家族的重要成員,近來研究報(bào)道HSP27有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。本實(shí)驗(yàn)旨在探討HSP27在Hcy引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。方法：1. Western blot檢測Hcy作用下HUVECs中HSP27基因表達(dá)變化；2.構(gòu)建高表達(dá)HSP27的HUVECs細(xì)胞系,應(yīng)用熒光顯微鏡、qRT-PCR和Western blot鑒定HSP27高表達(dá)效果；3.亞硝酸還原法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中NO水平的變化；qRT-PC R檢測內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的r iRNA表達(dá)變化；4. AnnexinV-PI染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測高表達(dá)HSP27對(duì)細(xì)胞凋亡的影響；5. Western blot檢測高表達(dá)HSP27對(duì)Hcy處理的HUVECs中DAPK表達(dá)的影響；6.流式細(xì)胞術(shù)檢測高表達(dá)HSP27對(duì)ROS水平和線粒體膜電勢的影響；7. Western b lot檢測高表達(dá)HSP27對(duì)線粒體凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、 Bax、caspase-3及 PARP表達(dá)的影響。結(jié)果：1.Hcy上調(diào)HUVECs中 HSP27的表達(dá),并呈劑量依賴性。2.高表達(dá)HSP27的HUVECs細(xì)胞系能穩(wěn)定高表達(dá)HSP27。3. HSP27能減弱Hcy對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)NO和細(xì)胞因子的影響。4.HSP27能抑制Hcy引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。5.高表達(dá)HSP27不影響DAPK的表達(dá)變化。6.HSP27能減弱Hcy誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生和MMP喪失。7.HSP27能促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá),抑制Bax活化,抑制caspase-3和PARP活化。結(jié)論：1.Hcy通過上調(diào)DAPK的表達(dá),進(jìn)而影響B(tài)cl-2/Bax的比率、活化caspase-3介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷。2.HSP27可能通過調(diào)節(jié)ROS水平和DAPK下游的線粒體凋亡途徑來抑制Hcy誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,從而發(fā)揮保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R543.5

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本文編號(hào)：2441120