【摘要】：一、研究背景近年來,經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(PCI)已經(jīng)廣泛的用于治療血管壁粥樣硬化引起的冠狀動脈狹窄。然而,有相當(dāng)一部分患者術(shù)后發(fā)生病變處血管的再狹窄,從而降低了PCI的療效,并且增加再發(fā)心血管事件的風(fēng)險。目前認為損傷血管修復(fù)過程中,新生內(nèi)膜的異常增生是發(fā)生PCI術(shù)后再狹窄的病理生理基礎(chǔ)。而血管平滑肌細胞的增殖和遷移能力的增強,是血管損傷后新生內(nèi)膜增生,從而導(dǎo)致管腔狹窄的重要原因。而血管平滑肌細胞具有顯著的表觀可塑性,使其可快速適應(yīng)周圍環(huán)境的改變。當(dāng)受到細胞外基質(zhì)成分、細胞因子、剪切力、氧自由基等因素的刺激后,血管平滑肌細胞會顯著降低血管平滑肌細胞分化標(biāo)志物的表達,提高增殖,遷移和合成的細胞外基質(zhì)的能力,以參與新生內(nèi)膜的形成。血管平滑肌細胞表型的開關(guān)在血管疾病中發(fā)揮重要的作用,因此,認識血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化的分子機制,有可能為防治PCI術(shù)后再狹窄提供調(diào)控的靶點。OCT4由Pou5fl基因編碼產(chǎn)生,主要定位于細胞核,其在胚胎干細胞及間充質(zhì)干細胞等未/低分化細胞高表達,而在高度分化的成體細胞正常情況下則幾乎不表達。近年來,隨著對OCT4研究的深入,發(fā)現(xiàn)OCT4除了在干細胞和生殖細胞腫瘤中高表達以外,還在非生殖系統(tǒng)的腫瘤細胞中同樣有表達。不僅如此,OCT4甚至在成體細胞和異位的子宮內(nèi)膜組織中再表達,并且使腫瘤細胞和成體細胞表現(xiàn)出易于遷移和增殖的表型。這些研究結(jié)果提示,OCT4極可能在某些病理狀態(tài)下被激活,從而在細胞去分化的過程中起到重要的作用,并使得細胞表現(xiàn)出更容易增殖、遷移等具有去分化表型的能力。目前,在心血管疾病的發(fā)病機制研究中,關(guān)于OCT4的作用鮮有報道。本課題旨在通過在體外和體內(nèi)實驗,觀察OCT4對細胞增殖和遷移的調(diào)節(jié)作用,以及對下游靶基因的調(diào)控機制。二、研究目的1、刺激人主動脈平滑肌細胞,檢測OCT4的表達,并通過過表達和抑制的方法觀察OCT4對血管平滑肌細胞增殖遷移的影響;2、在小鼠頸動脈損傷模型上觀察OCT4對血管新生內(nèi)膜增殖的調(diào)節(jié)；3、用生物學(xué)方法檢測與OCT4可能相互作用的靶基因,明確其對血管平滑肌細胞功能的調(diào)控作用。三、研究方法(一)第一部分用腫瘤壞死因子-α,白介素-1-β,血小板衍生生長因子-BB,轉(zhuǎn)化生長因子-p刺激人主動脈平滑肌細胞,用定量PCR和western blot的方法檢測OCT4的表達情況。在血管平滑肌細胞中過表達和抑制OCT4,用CCK-8、平板劃線,transwell實驗的方法檢測OCT4在血管平滑肌細胞增殖和遷移中的作用。(二)第二部分建立小鼠頸總動脈損傷模型,小鼠隨機分為以下幾組：1、頸動脈損傷組；2、頸動脈損傷+OCT4腺病毒轉(zhuǎn)染組；3、頸動脈損傷+GFP腺病毒轉(zhuǎn)染組；4、頸動脈損傷+siRNAocT4轉(zhuǎn)染組；5、頸動脈損傷+siRNACTRL轉(zhuǎn)染組,對側(cè)血管作為Sham對照。分別在損傷后3天,7天,14天處死老鼠,做組織切片HE染色,免疫組化,定量PCR等,并測量小鼠內(nèi)膜和中膜的面積,計算內(nèi)膜／中膜比值。在小鼠損傷血管中,對OCT4的表達做定位和定量分析。在小鼠損傷血管過表達和抑制OCT4的表達,用組織切片HE染色,定量PCR等實驗方法,檢測OCT4在血管新生內(nèi)膜形成中的作用。(三)第三部分在血管平滑肌細胞中過表達OCT4,用定量PCR的方法用篩選在血管平滑肌細胞中可能受到OCT4調(diào)控的靶基因。選擇下游基因進行細胞功能測試。四、研究結(jié)果(一)第一部分血管平滑肌細胞中OCT4的mRNA水平在白介素-1-β,腫瘤壞死因子-α,PDGF-BB,轉(zhuǎn)化生長因子-p刺激下,發(fā)生不同程度的改變。PDGF-BB刺激血管平滑肌細胞,誘導(dǎo)OCT4表達呈時間和劑量依賴性。在血管平滑肌細胞過表達OCT4,平板劃線和transwell實驗結(jié)果提示轉(zhuǎn)染Ad-OCT4的血管平滑肌細胞遷移數(shù)量較轉(zhuǎn)染Ad-GFP的細胞多,CCK-8結(jié)果提示轉(zhuǎn)染Ad-OCT4的血管平滑肌細胞增殖的數(shù)量較轉(zhuǎn)染Ad-GFP的細胞多。siRNA轉(zhuǎn)染PDGF-BB誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞,轉(zhuǎn)染siRNAOCT4的血管平滑肌細胞遷移數(shù)量較轉(zhuǎn)染siRNACTRL時細胞少,CCK-8結(jié)果提示轉(zhuǎn)染siRNAOCT4的血管平滑肌細胞增殖的數(shù)量較轉(zhuǎn)染siRNACTRL的細胞少。(二)第二部分1、在小鼠頸動脈損傷后14天的頸動脈橫切片上,經(jīng)免疫熒光雙標(biāo)染色顯示OCT4表達在新生內(nèi)膜血管平滑肌細胞中,且為核表達。OCT4特異性抗體對組織切片進行免疫組化染色顯示OCT4在損傷后第7天在新生內(nèi)膜有表達,14天在內(nèi)膜的表達較第7天顯著增加,提示OCT4的表達隨損傷時間而增多。損傷血管的OCT4的mRNA水平較未損傷的對照組升高(P0.05)。2、轉(zhuǎn)染Ad-OCT4腺病毒組,損傷的小鼠頸動脈血管內(nèi)膜面積(32.45±1.82)×103μm2明顯大于感染Ad-GFP腺病毒組(21.48±0.75)×103μm2 (P0.05)。轉(zhuǎn)染Ad-OCT4腺病毒組新生內(nèi)膜/中膜的比值(1.03±0.07)明顯大于感染Ad-GFP腺病毒組(0.74±0.06;P0.05)。3、未損傷組的小鼠血管內(nèi)彈力板完整,管壁光滑,無內(nèi)膜增生;siRNA oCT4或者siRNACTRL。siRNACTRL轉(zhuǎn)染損傷的小鼠頸動脈組可見中膜內(nèi)排列紊亂的平滑肌細胞,血管平滑肌細胞的細胞核明顯增大變圓,損傷血管內(nèi)膜可見彌漫性增厚,伴有明顯管腔的縮小。而轉(zhuǎn)染siRNAOCT4組盡管也可見中膜平滑肌細胞排列紊亂,但損傷血管內(nèi)膜彌漫性增厚的程度較前者較輕,且管腔的縮小明顯較輕。血管內(nèi)膜面積(4.95±1.54)×103μm2明顯小于siRNAcTRL組(23.53±2.18)×103μm2(P0.05)。新生內(nèi)膜/中膜比值也明顯小于siRNACTRL組(0.19±0.06 VS 0.89±0.14; P0.05)。(三)第三部分1、在過表達OCT4的血管平滑肌細胞中,表達升高達到統(tǒng)計學(xué)差異的基因有：Sox2, Nanog, BMP4, Etv5, Etv1, Foxd3, KLF4, KLF5, Gadd45a, MMP2, MMP9;表達下降達到統(tǒng)計學(xué)差異的基因有：TCF3, Vegfc, DUSP27, Tns3, Psme4。2、MMP2在過表達OCT4的血管平滑肌細胞細胞中,RNA水平和蛋白水平均顯著升高。siRNAMMP2轉(zhuǎn)染組血管平滑肌細胞的增殖較對照組降低但未達到統(tǒng)計學(xué)差異,轉(zhuǎn)染了siRNAMMP2以后,穿過劃線的平滑肌細胞較對照組的數(shù)量顯著降低,穿過小室的平滑肌細胞也較對照組的數(shù)量顯著降低。五、結(jié)論1.不同刺激因子使血管平滑肌細胞的OCT4的表達發(fā)生變化。OCT4促進血管平滑肌細胞的增殖和遷移。抑制OCT4表達可以抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移。2.OCT4在小鼠頸動脈損傷模型中升高,主要在新生內(nèi)膜的血管平滑肌細胞中表達。過表達OCT4促進小鼠頸動脈損傷的新生內(nèi)膜的增生。下調(diào)OCT4抑制小鼠頸動脈損傷的新生內(nèi)膜的增生。3.OCT4調(diào)控血管平滑肌細胞,是通過對一些基因的調(diào)節(jié)。MMP2作為OCT4的下游基因,參與了OCT4調(diào)控的血管平滑肌細胞的遷移,可能影響細胞增殖。4.OCT4可能作為冠心病,支架植入術(shù)后再狹窄等血管增殖性疾病新的治療方向,為臨床的應(yīng)用提供的新的思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R54

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