【摘要】：血管新生是在已有血管的基礎(chǔ)上長出新的血管并形成血管網(wǎng)絡(luò)的生物學(xué)過程,涉及到細(xì)胞的增殖、遷移、管腔形成、血管成熟和血管重構(gòu)等一系列過程,這一事件是多種細(xì)胞、生長因子、細(xì)胞外基質(zhì)共同參與的一個復(fù)雜過程,多種信號分子和信號途徑參與其中。VSMCs的表型轉(zhuǎn)化及增殖和遷移是血管損傷后或動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生過程中的內(nèi)膜過度增生的重要原因,導(dǎo)致這一事件的誘導(dǎo)因素有炎癥反應(yīng)、機械損傷、氧化應(yīng)激等,其中氧化應(yīng)激因素非常重要。Ox-LDL是促進(jìn)VSMCs增殖和遷移的主要氧化應(yīng)激因子之一。過去的研究表明,AAMP是一個與細(xì)胞遷移有關(guān)的蛋白,這意味著AAMP可能具有促血管新生的特性。但AAMP到底會不會參與血管新生過程,目前還缺乏體內(nèi)外的實驗證據(jù)。另外,AAMP和ox-LDL都在內(nèi)膜增生的過程中有重要作用,但AAMP是否在ox-LDL促進(jìn)的VSMCs遷移中起作用尚不明確。因此,本研究旨在明確AAMP蛋白在血管新生和VSMCs遷移過程中的作用及其分子機制。通過構(gòu)建AAMP高表達(dá)和干擾表達(dá)載體,結(jié)合多種細(xì)胞分子生物學(xué)的實驗技術(shù)方法研究AAMP調(diào)控血管新生和VSMCs遷移及具體的細(xì)胞分子生物學(xué)機制。本論文的主要研究內(nèi)容和結(jié)論如下:1)首先,通過生物信息學(xué)軟件分析預(yù)測了AAMP的基因和蛋白結(jié)構(gòu)。主要研究結(jié)論如下:AAMP是一個在進(jìn)化上非常保守的蛋白,不同物種的AAMP蛋白一級結(jié)構(gòu)差異較小,有大量保守的結(jié)構(gòu)基序。人AAMP基因位于第2號染色體的長臂上,由10個內(nèi)含子和11個外顯子構(gòu)成。AAMP蛋白中有8個WD40結(jié)構(gòu)域,三維結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示AAMP蛋白可以形成一個螺旋槳樣的三維結(jié)構(gòu)。并且AAMP可能與NOD1、CDC20等蛋白相互作用。2)然后,實驗研究了AAMP的表達(dá)模式和對血管新生的作用。實驗通過蛋白免疫印跡、細(xì)胞免疫熒光及反轉(zhuǎn)錄RCR技術(shù)研究了AAMP在正常細(xì)胞、癌細(xì)胞、小鼠多種組織中的表達(dá)情況。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),AAMP在正常的組織細(xì)胞中和癌細(xì)胞中都有表達(dá),并且大部分的AAMP都定位于細(xì)胞的胞漿區(qū)域。AAMP在小鼠多種組織器官中都有表達(dá),具有豐富微血管結(jié)構(gòu)并且代謝比較旺盛的組織中AAMP的表達(dá)較高。通過構(gòu)建小鼠后肢缺血的血管新生模型發(fā)現(xiàn),AAMP在缺血誘導(dǎo)的組織中表達(dá)量增加,因此AAMP可能參與血管新生過程。構(gòu)建針對AAMP的干擾RNA表達(dá)載體研究AAMP對血管新生的調(diào)控作用,發(fā)現(xiàn)在HUVECs中干擾AAMP的表達(dá)后內(nèi)皮細(xì)胞在三維基質(zhì)上的管腔形成能力減弱。并且AAMP的特異性抗體抑制AAMP的功能后血管環(huán)出芽性血管新生減少。總之,AAMP在血管新生的過程中表達(dá)升高,AAMP主要通過調(diào)控內(nèi)皮出芽和管腔形成調(diào)控血管新生。3)接下來,對AAMP調(diào)控血管新生的細(xì)胞分子機制進(jìn)行了詳細(xì)研究。通過構(gòu)建帶FLAG標(biāo)簽的AAMP真核表達(dá)載體,并用anti-FLAG抗體和anti-AAMP抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色,發(fā)現(xiàn)在HUVECs中外源性和內(nèi)源性的AAMP都主要定位于胞漿,并且在細(xì)胞膜上也有分布;在EA.hy926細(xì)胞中,AAMP也主要位于細(xì)胞質(zhì)中。研究發(fā)現(xiàn),VEGF可以促進(jìn)AAMP的表達(dá),并且VEGF可以促進(jìn)AAMP向細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)移,尤其在細(xì)胞邊緣的突起部分AAMP蛋白聚集較多。但干擾AAMP的表達(dá)不利于細(xì)胞膜突起結(jié)構(gòu)的形成,并且會造成細(xì)胞邊緣膜結(jié)構(gòu)上的AAMP蛋白含量降低。研究還發(fā)現(xiàn)AAMP通過調(diào)控細(xì)胞遷移、細(xì)胞粘附和鋪展參與血管新生。干擾AAMP的表達(dá)后抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移,細(xì)胞粘附能力減弱,細(xì)胞粘附后的鋪展面積減小,細(xì)胞內(nèi)應(yīng)力纖維束減少,細(xì)胞的收縮能力變?nèi)�。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),Rho A/ROCK信號參與AAMP調(diào)控的血管新生。干擾AAMP表達(dá)或抗體抑制AAMP后抑制了Rho A向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)移;Rho A/ROCK抑制劑Y27632抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管新生活性。通過構(gòu)建AAMP的高表達(dá)載體在HUVECs中高表達(dá)AAMP后發(fā)現(xiàn),高表達(dá)外源性AAMP可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、細(xì)胞骨架應(yīng)力纖維的形成及細(xì)胞收縮并促進(jìn)管腔形成,但不能挽救Y27632對血管新生的抑制效應(yīng)。因此,AAMP可以促進(jìn)Rho A/ROCK信號的激活,因此Rho A/ROCK信號是AAMP的下游信號分子。4)由于PPARγ信號的激活可以抑制細(xì)胞遷移和AAMP的表達(dá)。但PPARγ信號活化后對AAMP調(diào)控的血管新生的影響還不知道。本實驗進(jìn)一步研究了羅格列酮(RSG)激活的PPARγ信號可以負(fù)調(diào)控AAMP促進(jìn)的血管新生。PPARγ激動劑RSG既可以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成,也可以抑制主動脈環(huán)出芽性血管新生;PPARγ的拮抗劑GW9662預(yù)處理后可以顯著減弱RSG對血管新生的抑制作用。RSG既可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移,也可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,但PPARγ拮抗劑GW9662預(yù)處理則會解除RSG對細(xì)胞遷移和增殖的抑制作用。因此,RSG抑制血管新生是通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖起作用的,并且這一過程可能依賴于PPARγ。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),RSG可以抑制AAMP的表達(dá),但GW9662可以解除RGS對AAMP表達(dá)的抑制作用。RSG還可以促進(jìn)PPARγ的表達(dá)升高并向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移。這進(jìn)一步證明,RSG抑制AAMP表達(dá)通過PPARγ起作用。AAMP高表達(dá)可以緩解RSG對血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和管腔形成的抑制,但不能回救對細(xì)胞增殖的抑制。因此,RSG抑制細(xì)胞遷移和血管新生在一定程度上是通過促進(jìn)PPARγ的表達(dá)和向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移從而抑制AAMP蛋白表達(dá)來實現(xiàn)的。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),p53信號介導(dǎo)RSG對AAMP表達(dá)和血管新生的抑制。RSG可以促進(jìn)p53的表達(dá)上調(diào)和向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移,抑制p53的活性后AAMP的表達(dá)增加。RSG可以抑制VEGF誘導(dǎo)的AAMP向細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)移,但GW9662和p53抑制劑Pifithrin-α則會緩解RSG的這種抑制作用。因此,RSG抑制AAMP向細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)移與PPARγ信號的激活和p53的表達(dá)上調(diào)相關(guān)。Pifithrin-α可以減弱RSG對內(nèi)皮細(xì)胞遷移、管腔形成和三維基質(zhì)中培養(yǎng)的主動脈環(huán)的出芽性血管新生的抑制。5)此外,由于ox-LDL和VSMCs的遷移在動脈粥樣硬化病理過程中的重要作用,實驗還研究了不同濃度的ox-LDL對VSMCs的遷移和AAMP表達(dá)的影響,并研究了AAMP參與ox-LDL調(diào)控的VSMCs遷移的機制。實驗研究發(fā)現(xiàn),較低濃度(12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml)的ox-LDL可以促進(jìn)VSMCs的遷移,而高濃度(100μg/ml)的ox-LDL則誘導(dǎo)VSMCs的凋亡。較低濃度(12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml)的ox-LDL可以促進(jìn)VSMCs對脂質(zhì)的吸收和脂質(zhì)積累,而較高濃度(100μg/ml)的ox-LDL則會抑制VSMCs對脂質(zhì)的吸收和胞內(nèi)脂質(zhì)積累。低濃度(25μg/ml)的ox-LDL可以誘導(dǎo)AAMP的表達(dá)和小G蛋白Rac I和Rho A向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)移,而較高濃度(100μg/ml)的ox-LDL刺激條件下AAMP的表達(dá)無顯著變化。干擾AAMP的表達(dá)可以抑制25μg/ml的ox-LDL誘導(dǎo)的Rho A向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)移和細(xì)胞遷移。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),整合素β3可以通過促進(jìn)Rho A信號的活化來促進(jìn)VSMCs的遷移,并且這一過程與AAMP向細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)移有關(guān)。總之,較低濃度的ox-LDL可以促進(jìn)AAMP的表達(dá),AAMP通過促進(jìn)Rho A向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移促進(jìn)細(xì)胞遷移,并且整合素β3可以通過促進(jìn)Rho A信號的活化來促進(jìn)VSMCs的遷移。綜上所述,通過本研究的一系列研究工作我們明確了AAMP在血管新生和ox-LDL促進(jìn)VSMCs遷移中的作用。首先,AAMP可以促進(jìn)血管新生。AAMP既可以促進(jìn)內(nèi)皮出芽、也可以促進(jìn)管腔形成,AAMP調(diào)控血管新生主要通過調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞遷移起作用。AAMP通過PPARγ-p53-AAMP-Rho A/ROCK信號通路調(diào)控細(xì)胞遷移和血管新生過程。另外,AAMP參與較低濃度的ox-LDL誘導(dǎo)的VSMCs遷移。較低濃度的ox-LDL可以誘導(dǎo)AAMP的表達(dá)和Rho A向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)移,Rho A的膜轉(zhuǎn)移和活化依賴于AAMP,并且整合素β3也參與這一過程。本研究揭示了AAMP對血管新生和VSMCs遷移的調(diào)控作用及分子機制,將為進(jìn)一步研究AAMP在動脈粥樣硬化疾病中的作用及機制提供理論基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R54

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2437858