【摘要】：目的:超極化激活環(huán)核苷酸門控通道(hyperpolarization-activation cyclic nucleotide-gated channel,HCN channel)是一類非選擇性的陽(yáng)離子通道。研究表明在哺乳類動(dòng)物心臟上表達(dá)有HCN1、HCN2、HCN4三種通道亞型,其中HCN2、HCN4在正常情況下共同參與并維持心臟正常生理活動(dòng)。HCN通道介導(dǎo)的起搏電流If為一類超極化激活電流,在心臟自主節(jié)律的形成和變時(shí)功能調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要的生理及病理生理學(xué)功能。采用模型細(xì)胞異源表達(dá)HCN通道,并成功記錄到由該離子通道介導(dǎo)的超極化激活電流,從而證實(shí)該電流的分子基礎(chǔ)為HCN通道蛋白。心房顫動(dòng)(Atrial Fibrillation,AF),簡(jiǎn)稱房顫,是臨床最常見的快速型心律失常之一。大量研究顯示,相對(duì)于竇性心律患者,房顫患者心房肌組織中HCN通道表達(dá)異常增加,因此推測(cè)HCN通道可能是房顫治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。伊伐布雷定(Ivabradine,Iva)是一種If電流的選擇特異性阻滯劑,目前適用于慢性穩(wěn)定性心絞痛、心力衰竭等心血管疾病的藥物治療。臨床研究表明,伊伐布雷定可降低快速型心律失常的發(fā)生率及持續(xù)時(shí)間,但具體作用機(jī)制仍未闡明。本實(shí)驗(yàn)擬在新生大鼠心房肌細(xì)胞上建立快速起搏模型,探討伊伐布雷定對(duì)HCN通道的表達(dá)及功能的影響,進(jìn)而改善心房肌細(xì)胞凋亡水平,減輕房顫狀態(tài)下心房結(jié)構(gòu)重構(gòu),為該藥在抗房顫的藥物治療方面提供更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。方法:(1)原代新生大鼠心房肌細(xì)胞分離及培養(yǎng):選取出生1~3天的Sprague Dawley(SD)大鼠。在相對(duì)無(wú)菌環(huán)境下,固定乳大鼠的四肢,于胸骨劍突下開胸,完全暴露心臟后,使用無(wú)菌鑷子夾取完整心臟放入盛有無(wú)菌PBS的P6培養(yǎng)皿中,擠壓心腔中殘留血液后,將心臟轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中,分離出左、右心耳,收集并轉(zhuǎn)移心耳組織至T25玻璃培養(yǎng)瓶中,加入0.25%胰蛋白酶2 ml,靜置于4℃環(huán)境,14~16 h后終止胰蛋白酶的消化。繼續(xù)用II型膠原酶消化液在37℃水浴條件下消化5~10 min,離心后收集心房肌細(xì)胞并接種于P10培養(yǎng)皿,放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行差速貼壁,收集細(xì)胞懸液均勻接種于P6培養(yǎng)皿或者6孔板,細(xì)胞個(gè)數(shù)約1×104/cm2,并加入成纖維細(xì)胞抑制劑5-Brdu(終濃度:100μM),于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),24 h后倒置相差顯微鏡觀察,細(xì)胞貼壁良好,更換新的完全培養(yǎng)基,以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。(2)進(jìn)行心肌細(xì)胞鑒定。將心房肌細(xì)胞隨機(jī)分為4組:對(duì)照組(Control):完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng);藥物干預(yù)組(Iva):在培養(yǎng)基中加入終濃度為10μM的Ivabradine;電刺激組(Pacing):建立快速起搏模型,給予心房肌細(xì)胞強(qiáng)度10 V、頻率10 Hz、時(shí)長(zhǎng)24 h的持續(xù)電刺激;電刺激干預(yù)組(Pacing+iva):在給予心房肌細(xì)胞同條件電刺激的同時(shí)加入終濃度10μM Ivabradine進(jìn)行藥物干預(yù);(3)Real-Time PCR檢測(cè)各組m RNA、micro RNA表達(dá)差異:1)提取心房肌細(xì)胞中的總RNA,260/280均在1.8~2.0之間;繼而采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,將已提取出的心房肌總RNA逆轉(zhuǎn)錄為c DNA,采用SYBR Green I法Real-Time PCR檢測(cè)各組間HCN2、HCN4 m RNA水平的差異。2)使用mir Vana TMmi RNA Isolation Kit試劑盒提取心房肌細(xì)胞micro RNA,按照All-in-One TMmi RNA q RT-PCR試劑盒檢測(cè)各組micro RNA-1、micro RNA-133的表達(dá)差異。(4)Western blotting實(shí)驗(yàn):RIPA(含蛋白酶抑制劑)提取心房肌細(xì)胞總蛋白,采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品蛋白質(zhì)濃度,變性備用。取心房肌細(xì)胞總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,室溫封閉2 h,一抗4℃孵育過(guò)夜,二抗常溫孵育1 h后,運(yùn)用Bio-Rad凝膠成像處理系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶,采用Quantity One軟件分析各組間HCN2、HCN4以及凋亡誘導(dǎo)因子(Apoptosis-inducing factor,AIF)的蛋白表達(dá)差異。(5)流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry,FCM):采用凋亡試劑盒,按照說(shuō)明對(duì)各組心房肌細(xì)胞進(jìn)行處理,流式細(xì)胞儀對(duì)各組心房肌細(xì)胞進(jìn)行凋亡細(xì)胞檢測(cè)。(6)全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn):于倒置相差顯微鏡下選擇立體感好、折光性強(qiáng)的單個(gè)心房肌細(xì)胞進(jìn)行If電流記錄。結(jié)果:(1)Real-Time PCR實(shí)驗(yàn):1)Iva組較Control組HCN2 m RNA表達(dá)量上調(diào)(n=6,P0.01),HCN4 m RNA表達(dá)量上調(diào)(n=6,P0.05);Pacing組較Control組HCN2 m RNA表達(dá)量上調(diào)(n=6,P0.01),HCN4 m RNA表達(dá)量上調(diào)(n=6,P0.05);Pacing+iva組較Pacing組HCN2 m RNA表達(dá)量下調(diào)(n=6,P0.05),HCN4 m RNA表達(dá)量下調(diào)(n=6,P0.05);2)Iva組較Control組micro RNA-1表達(dá)量下調(diào)(n=6,P0.01),micro RNA-133表達(dá)量下調(diào)(n=6,P0.01);Pacing組較Control組micro RNA-1表達(dá)量下調(diào)(n=6,P0.01),micro RNA-133表達(dá)量下調(diào)(n=6,P0.01);Pacing+iva組較Pacing組micro RNA-1表達(dá)量上調(diào)(n=6,P0.01),micro RNA-133表達(dá)量上調(diào)(n=6,P0.01)。(2)Western blotting實(shí)驗(yàn):Iva組較Control組HCN2通道蛋白表達(dá)量上調(diào)(n=5,P0.01),HCN4通道蛋白表達(dá)量上調(diào)(n=5,P0.01),AIF表達(dá)無(wú)明顯差異(n=5,P0.05);Pacing組較Control組HCN2通道蛋白表達(dá)量上調(diào)(n=5,P0.01),HCN4通道蛋白表達(dá)量上調(diào)(n=5,P0.01),AIF表達(dá)量明顯增加(n=5,P0.01);Pacing+iva組較Pacing組HCN2通道蛋白表達(dá)量下調(diào)(n=5,P0.01),HCN4通道蛋白表達(dá)量下調(diào)(n=5,P0.01),AIF表達(dá)量顯著下降(n=5,P0.01)。(3)流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry,FCM):Iva組較Control組心房肌細(xì)胞早期凋亡率無(wú)明顯變化(n=5,P0.05);Pacing組較Control組心房肌細(xì)胞早期凋亡率顯著升高(n=5,P0.01);Pacing+iva組較Pacing組心房肌細(xì)胞早期凋亡率明顯下降(n=5,P0.01)。(4)全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn):膜電位為-150 m V時(shí),Iva組較Control組,心房肌細(xì)胞If電流密度顯著減小:-4.83±1.97p A/p F Vs.-12.49±3.26 p A/p F(n=6,P0.01);Pacing組較Control組,心房肌細(xì)胞If電流密度增大:-17.32±2.73 p A/p F Vs.-12.49±3.26 p A/p F(n=6,P0.05);Pacing+iva組較Pacing組,心房肌細(xì)胞If電流密度明顯減小:-5.05±2.27 p A/p F Vs.-17.32±2.73 p A/p F(n=6,P0.01)。結(jié)論:(1)胰蛋白酶聯(lián)合II型膠原酶消化法,培養(yǎng)的心房肌細(xì)胞數(shù)量多,貼壁好,具有良好心肌細(xì)胞電生理特性,可供后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和電生理研究使用;(2)成功建立了新生大鼠心房肌細(xì)胞快速起搏模型,該模型可用于模擬房顫的病理狀態(tài);(3)HCN2、HCN4通道的表達(dá)及功能改變與房顫致心房肌細(xì)胞凋亡相關(guān);(4)伊伐布雷定通過(guò)抑制HCN2、HCN4通道基因、蛋白的表達(dá),抑制起搏電流If幅度,降低心房肌細(xì)胞的凋亡率,減輕房顫所致的心房肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R541.75

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2409043