發(fā)布時(shí)間：2018-12-27 14:15

【摘要】：研究背景及目的：隨著我國(guó)風(fēng)濕熱發(fā)病率下降及老齡化加劇,退行性鈣化性主動(dòng)脈瓣膜病(DCAVD)成為老年人最常見(jiàn)的心臟瓣膜病。目前DCAVD已成為我國(guó)老年人心衰、暈厥甚至猝死的主要病因之一,尚無(wú)有效藥物能預(yù)防或延緩其進(jìn)展,手術(shù)仍是最有效的治療手段,這給患者家庭及社會(huì)帶來(lái)了巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。探討DCAVD發(fā)病機(jī)制,從而及時(shí)有效的干預(yù)其進(jìn)展,將具有極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。既往認(rèn)為DCAVD是退行性鈣磷沉積不可逆的被動(dòng)過(guò)程,近年來(lái)研究表明DCAVD是類似成骨樣分化受多因素調(diào)控的主動(dòng)過(guò)程,涉及慢性炎癥反應(yīng)、脂代謝異常及鈣鹽沉積等。至今,DCAVD發(fā)病機(jī)制仍不清楚,有待進(jìn)一步研究。Mohler等已分離出瓣膜間質(zhì)細(xì)胞(VICs),并證實(shí)其在特定條件下可轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞樣細(xì)胞,并形成鈣結(jié)節(jié)。研究證實(shí)主動(dòng)脈鈣化瓣膜中成骨細(xì)胞和骨組織的標(biāo)志物表達(dá)升高,如堿性磷酸酶、骨鈣蛋白、骨橋蛋白等,提示鈣化相關(guān)因子可能參與DCAVD發(fā)病過(guò)程,VICs向成骨細(xì)胞分化可能是DCAVD發(fā)病的重要基礎(chǔ)。microRNAs是細(xì)胞內(nèi)重要的非編碼調(diào)控分子,可參與調(diào)控多種生理和病理過(guò)程。VICs結(jié)合miRNA是研究DCAVD發(fā)病機(jī)制的一個(gè)新視角,存在為DCAVD提供早期診斷及治療的潛在價(jià)值。本研究采用niRNA芯片技術(shù)篩選出調(diào)控DCAVD相關(guān)的miRNAs,從中選取miRNA-449c-5p作為研究對(duì)象,進(jìn)一步驗(yàn)證其功能,通過(guò)RT-PCR、Western blot等技術(shù)探討其調(diào)控機(jī)制,以期闡明DCAVD發(fā)病機(jī)制,尋找其早期診斷及干預(yù)措施。感染性心內(nèi)膜炎(IE)是指心臟內(nèi)膜微生物感染,可伴贅生物形成,近年來(lái)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。關(guān)于活動(dòng)期IE手術(shù)時(shí)機(jī)及效果的選擇目前仍存在爭(zhēng)議,傳統(tǒng)上多傾向于內(nèi)科治療,即手術(shù)多在正規(guī)有效抗感染4-6周,體溫正常,血培養(yǎng)陰性后進(jìn)行,但在此期間,易發(fā)生心功能不全、栓塞等,病死率較高。本研究擬通過(guò)分析活動(dòng)期IE血培養(yǎng)及藥敏結(jié)果,為合理選擇抗生素提供依據(jù),并進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪,以探討早期手術(shù)療效。研究方法：第一部分1、差異miRNAs篩選及目標(biāo)miRNA確定：對(duì)瓣膜鈣化組織和相對(duì)正常組織提取RNA,通過(guò)miRNA芯片技術(shù)測(cè)定miRNA表達(dá)情況,篩選出差異miRNAs,從差異miRNAs中選取miRNA-449c-5p作為研究對(duì)象,通過(guò)RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證其差異表達(dá)。2、VICs培養(yǎng)和鑒定：術(shù)中留取人正常主動(dòng)脈瓣膜,采用改進(jìn)的膠原酶消化法獲取VICs,并對(duì)VICs進(jìn)行細(xì)胞表型鑒定。3、差異性表達(dá)1niRNA-449c-5p的功能驗(yàn)證:將miRNA-449c-5p mimics、inhibitor和negative control分別導(dǎo)入VICs,模擬過(guò)表達(dá)和低表達(dá)miRNA-449c-5p,進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率測(cè)定,然后進(jìn)行成骨誘導(dǎo),在7天和14天進(jìn)行RT-PCR、Western blot、ALP活性測(cè)定及茜素紅染色,驗(yàn)證miRNA-449c-5p對(duì)VICs成骨分化的影響。4、miRNA-449c-5p調(diào)控VICs成骨分化的機(jī)制：通過(guò)miRNA專業(yè)靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站,初步預(yù)測(cè)miRNA-449c-5p靶基因,再通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證兩者結(jié)構(gòu)匹配程度,最后通過(guò)SiRNA技術(shù)驗(yàn)證靶基因的真實(shí)性。5、VICs成骨誘導(dǎo)中,IL-6對(duì)miRNA-449c-5p的調(diào)控作用：首先,收集VICs成骨誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后24h、48h的培養(yǎng)基,檢測(cè)其IL-6濃度；其次,VICs培養(yǎng)基中,加入IL-6對(duì)其刺激,分別于加入前和加入后24h、48h收集細(xì)胞,行miRNA-449c-5p測(cè)定。6、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：將miRNA-449c-5p agomirs、antagomirs及negative control分別經(jīng)尾靜脈注射入Balb/c小鼠體內(nèi),分別過(guò)表達(dá)和低表達(dá)miRNA-449c-5p,然后皮下注射Vitamin D3誘導(dǎo)軟組織鈣化,6周后行心臟超聲檢測(cè)。第二部分回顧性分析2010年5月至2014年7月我院收治的62例活動(dòng)期IE患者血培養(yǎng)結(jié)果及臨床資料,所有患者均早期外科治療,術(shù)后長(zhǎng)期隨訪。研究結(jié)果：1、成功篩選出DCAVD相關(guān)的差異miRNAs,并從中選取miRNA-449c-5p作為研究對(duì)象；2、成功分離出VICs,并對(duì)其表型進(jìn)行了鑒定,證實(shí)其達(dá)到體外實(shí)驗(yàn)要求；3、對(duì)miRNA-449c-5p進(jìn)行功能研究,動(dòng)物水平、細(xì)胞水平、蛋白水平和mRNA水平研究顯示,miRNA-449c-5p能夠調(diào)控VICs成骨分化；4、通過(guò)靶基因?qū)I(yè)預(yù)測(cè)網(wǎng)站,預(yù)測(cè)miRNA-449c-5p靶基因?yàn)镾mad4,通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn),確定Smad4為其靶基因,最終確定miRNA-449c-5p通過(guò)TGF-β/Smad通路調(diào)控VICs成骨分化；5、證實(shí)VICs成骨分化中,分泌型IL-6表達(dá)上調(diào),而IL-6刺激VICs可導(dǎo)致其miRNA-449c-5p表達(dá)下調(diào),從而證實(shí)DCAVD發(fā)病中IL-6可能調(diào)控miRNA-449c-5p的表達(dá)；6、活動(dòng)期IE主要病原菌為鏈球菌、糞腸球菌和金葡菌,圍術(shù)期死亡2例,余60例治愈出院,57例術(shù)后長(zhǎng)期隨訪心功能Ⅰ級(jí)42例,Ⅱ級(jí)15例,隨訪期均無(wú)IE復(fù)發(fā)。結(jié)論：1、篩選出DCAVD特異性miRNA表達(dá)譜；2、miRNA-449c-5p靶基因?yàn)镾mad4,通過(guò)TGF-β/Smad信號(hào)通路在體內(nèi)外水平調(diào)控VICs成骨分化；3、IE病原菌以革蘭氏陽(yáng)性菌為主,需根據(jù)藥敏結(jié)果合理選擇抗生素,早期手術(shù)治療活動(dòng)期IE臨床療效滿意。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R542.5

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本文編號(hào)：2393193