【摘要】：研究背景及目的：隨著我國風濕熱發(fā)病率下降及老齡化加劇,退行性鈣化性主動脈瓣膜病(DCAVD)成為老年人最常見的心臟瓣膜病。目前DCAVD已成為我國老年人心衰、暈厥甚至猝死的主要病因之一,尚無有效藥物能預防或延緩其進展,手術(shù)仍是最有效的治療手段,這給患者家庭及社會帶來了巨大經(jīng)濟負擔。探討DCAVD發(fā)病機制,從而及時有效的干預其進展,將具有極大的經(jīng)濟價值和社會價值。既往認為DCAVD是退行性鈣磷沉積不可逆的被動過程,近年來研究表明DCAVD是類似成骨樣分化受多因素調(diào)控的主動過程,涉及慢性炎癥反應、脂代謝異常及鈣鹽沉積等。至今,DCAVD發(fā)病機制仍不清楚,有待進一步研究。Mohler等已分離出瓣膜間質(zhì)細胞(VICs),并證實其在特定條件下可轉(zhuǎn)化為成骨細胞樣細胞,并形成鈣結(jié)節(jié)。研究證實主動脈鈣化瓣膜中成骨細胞和骨組織的標志物表達升高,如堿性磷酸酶、骨鈣蛋白、骨橋蛋白等,提示鈣化相關(guān)因子可能參與DCAVD發(fā)病過程,VICs向成骨細胞分化可能是DCAVD發(fā)病的重要基礎。microRNAs是細胞內(nèi)重要的非編碼調(diào)控分子,可參與調(diào)控多種生理和病理過程。VICs結(jié)合miRNA是研究DCAVD發(fā)病機制的一個新視角,存在為DCAVD提供早期診斷及治療的潛在價值。本研究采用niRNA芯片技術(shù)篩選出調(diào)控DCAVD相關(guān)的miRNAs,從中選取miRNA-449c-5p作為研究對象,進一步驗證其功能,通過RT-PCR、Western blot等技術(shù)探討其調(diào)控機制,以期闡明DCAVD發(fā)病機制,尋找其早期診斷及干預措施。感染性心內(nèi)膜炎(IE)是指心臟內(nèi)膜微生物感染,可伴贅生物形成,近年來發(fā)病率呈上升趨勢。關(guān)于活動期IE手術(shù)時機及效果的選擇目前仍存在爭議,傳統(tǒng)上多傾向于內(nèi)科治療,即手術(shù)多在正規(guī)有效抗感染4-6周,體溫正常,血培養(yǎng)陰性后進行,但在此期間,易發(fā)生心功能不全、栓塞等,病死率較高。本研究擬通過分析活動期IE血培養(yǎng)及藥敏結(jié)果,為合理選擇抗生素提供依據(jù),并進行長期隨訪,以探討早期手術(shù)療效。研究方法：第一部分1、差異miRNAs篩選及目標miRNA確定：對瓣膜鈣化組織和相對正常組織提取RNA,通過miRNA芯片技術(shù)測定miRNA表達情況,篩選出差異miRNAs,從差異miRNAs中選取miRNA-449c-5p作為研究對象,通過RT-PCR技術(shù)驗證其差異表達。2、VICs培養(yǎng)和鑒定：術(shù)中留取人正常主動脈瓣膜,采用改進的膠原酶消化法獲取VICs,并對VICs進行細胞表型鑒定。3、差異性表達1niRNA-449c-5p的功能驗證:將miRNA-449c-5p mimics、inhibitor和negative control分別導入VICs,模擬過表達和低表達miRNA-449c-5p,進行轉(zhuǎn)染效率測定,然后進行成骨誘導,在7天和14天進行RT-PCR、Western blot、ALP活性測定及茜素紅染色,驗證miRNA-449c-5p對VICs成骨分化的影響。4、miRNA-449c-5p調(diào)控VICs成骨分化的機制：通過miRNA專業(yè)靶基因預測網(wǎng)站,初步預測miRNA-449c-5p靶基因,再通過雙熒光素酶實驗,驗證兩者結(jié)構(gòu)匹配程度,最后通過SiRNA技術(shù)驗證靶基因的真實性。5、VICs成骨誘導中,IL-6對miRNA-449c-5p的調(diào)控作用：首先,收集VICs成骨誘導前和誘導后24h、48h的培養(yǎng)基,檢測其IL-6濃度；其次,VICs培養(yǎng)基中,加入IL-6對其刺激,分別于加入前和加入后24h、48h收集細胞,行miRNA-449c-5p測定。6、動物實驗：將miRNA-449c-5p agomirs、antagomirs及negative control分別經(jīng)尾靜脈注射入Balb/c小鼠體內(nèi),分別過表達和低表達miRNA-449c-5p,然后皮下注射Vitamin D3誘導軟組織鈣化,6周后行心臟超聲檢測。第二部分回顧性分析2010年5月至2014年7月我院收治的62例活動期IE患者血培養(yǎng)結(jié)果及臨床資料,所有患者均早期外科治療,術(shù)后長期隨訪。研究結(jié)果：1、成功篩選出DCAVD相關(guān)的差異miRNAs,并從中選取miRNA-449c-5p作為研究對象；2、成功分離出VICs,并對其表型進行了鑒定,證實其達到體外實驗要求；3、對miRNA-449c-5p進行功能研究,動物水平、細胞水平、蛋白水平和mRNA水平研究顯示,miRNA-449c-5p能夠調(diào)控VICs成骨分化；4、通過靶基因?qū)I(yè)預測網(wǎng)站,預測miRNA-449c-5p靶基因為Smad4,通過雙熒光素酶報告實驗,確定Smad4為其靶基因,最終確定miRNA-449c-5p通過TGF-β/Smad通路調(diào)控VICs成骨分化；5、證實VICs成骨分化中,分泌型IL-6表達上調(diào),而IL-6刺激VICs可導致其miRNA-449c-5p表達下調(diào),從而證實DCAVD發(fā)病中IL-6可能調(diào)控miRNA-449c-5p的表達；6、活動期IE主要病原菌為鏈球菌、糞腸球菌和金葡菌,圍術(shù)期死亡2例,余60例治愈出院,57例術(shù)后長期隨訪心功能Ⅰ級42例,Ⅱ級15例,隨訪期均無IE復發(fā)。結(jié)論：1、篩選出DCAVD特異性miRNA表達譜；2、miRNA-449c-5p靶基因為Smad4,通過TGF-β/Smad信號通路在體內(nèi)外水平調(diào)控VICs成骨分化；3、IE病原菌以革蘭氏陽性菌為主,需根據(jù)藥敏結(jié)果合理選擇抗生素,早期手術(shù)治療活動期IE臨床療效滿意。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R542.5

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 陳勇;劉巍;;microRNA影響抗腫瘤藥物敏感性相關(guān)研究進展[J];臨床腫瘤學雜志;2009年09期

2 牛曉曉;王秦秦;;microRNA與肺癌[J];中國肺癌雜志;2010年04期

3 劉靜;王小中;;慢性粒細胞白血病相關(guān)microRNA的研究進展[J];分子診斷與治療雜志;2010年04期

4 LEE Younghee;LUSSIER Yves A;;Identification of common microRNA-mRNA regulatory biomodules in human epithelial cancer[J];Chinese Science Bulletin;2010年31期

5 唐志強;;The effect of microRNA-21-siRNA-lentivirus on biological behaviors in human hepatic cancer cell line hepG2[J];China Medical Abstracts(Surgery);2012年01期

6 ;PTEN and PDCD4 are Bona Fide Targets of microRNA-21 in Human Cholangiocarcinoma[J];Chinese Medical Sciences Journal;2012年02期

7 林建宇;朱雨捷;王晶;湯溢飛;徐中華;;急性冠狀動脈綜合征相關(guān)microRNA靶向通路及其功能分析[J];蘇州大學學報(醫(yī)學版);2012年04期

8 崔洪亮;張陽德;;microRNA的協(xié)同調(diào)控網(wǎng)的構(gòu)建與研究[J];中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志;2012年33期

9 張明杰;徐卓明;朱麗敏;龔霄雷;黃蕊;;先天性心臟病重度肺動脈高壓血漿 microRNA 的分析與驗證[J];上海醫(yī)學;2013年12期

10 孟勝喜;胡義揚;馮琴;;microRNA在中醫(yī)藥防治非酒精性脂肪性肝病中的應用[J];中華中醫(yī)藥雜志;2014年03期

相關(guān)會議論文 前10條

1 荊清;袁文俊;秦永文;;microRNA的基因調(diào)控新功能[A];中國生理學會第五屆全國心血管、呼吸和腎臟生理學學術(shù)會議論文摘要匯編[C];2005年

2 靳新;駱志剛;王金華;管乃洋;;microRNA靶標研究進展[A];中國遺傳學會功能基因組學研討會論文集[C];2006年

3 ;Comparasion of Inhibitory Effects on Survivin Gene Expression in Prostate Cancer by Vector-based microRNA and siRNA[A];2008年全國生物化學與分子生物學學術(shù)大會論文摘要[C];2008年

4 朱丹霞;徐衛(wèi);繆扣榮;方成;朱華淵;董華潔;王冬梅;范磊;喬純;李建勇;;慢性淋巴細胞白血病microRNA異常表達研究[A];第13屆全國實驗血液學會議論文摘要[C];2011年

5 Yangchao Chen;;Small molecule modulators of microRNA-34a with anti-cancer activities[A];2013醫(yī)學前沿論壇暨第十三屆全國腫瘤藥理與化療學術(shù)會議論文集[C];2013年

6 金希;厲有名;;單純性脂變與非酒精性脂肪性肝炎間差異microRNA表達譜研究[A];2009香港-北京-杭州內(nèi)科論壇暨2009年浙江省內(nèi)科學學術(shù)年會論文匯編[C];2009年

7 賈新正;盧肖男;聶慶華;張細權(quán);;雞部分microRNA的同源預測與克隆驗證[A];中國動物遺傳育種研究進展——第十五次全國動物遺傳育種學術(shù)討論會論文集[C];2009年

8 李炯;段德民;鄭克孝;;新型非標記高通量microRNA芯片技術(shù)[A];第一屆全國生物物理化學會議暨生物物理化學發(fā)展戰(zhàn)略研討會論文摘要集[C];2010年

9 徐小濤;陸曉;孫婧;束永前;;肺癌側(cè)群細胞microRNA表達譜檢測及初步分析[A];2010’全國腫瘤分子標志及應用學術(shù)研討會暨第五屆中國中青年腫瘤專家論壇論文匯編[C];2010年

10 王俊峰;李巍;吳小江;阮康成;;大鼠附睪microRNA表達譜的研究[A];第十一次中國生物物理學術(shù)大會暨第九屆全國會員代表大會摘要集[C];2009年

相關(guān)重要報紙文章 前2條

1 陳英云 喬蕤琳;哈醫(yī)大成功研發(fā)國內(nèi)首例microRNA轉(zhuǎn)基因及敲減小鼠模型[N];黑龍江經(jīng)濟報;2010年

2 記者 陳青;2厘米以下肝癌檢出率88%[N];文匯報;2011年

相關(guān)博士學位論文 前10條

1 崔洪亮;microRNA的腫瘤表達研究及協(xié)同調(diào)控網(wǎng)絡分析[D];中南大學;2014年

2 馬建華;高粱低磷低氮形態(tài)生理特征及低氮響應的microRNA研究[D];山西農(nóng)業(yè)大學;2014年

3 李虔楨;microRNA相關(guān)基因遺傳多態(tài)性與冠心病臨床關(guān)聯(lián)及預后研究[D];福建醫(yī)科大學;2015年

4 王耀輝;血清microRNA作為乳腺癌診斷標志物的研究[D];復旦大學;2014年

5 周霽子;環(huán)境因素對心臟畸形胎兒影響的表觀遣傳學機制[D];復旦大學;2013年

6 張麗;microRNA通過調(diào)控小膠質(zhì)細胞炎性反應參與血管性認知障礙發(fā)生發(fā)展[D];復旦大學;2014年

7 查若鵬;肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)microRNA的鑒定及其分子機制研究[D];復旦大學;2013年

8 方硯田;結(jié)腸癌干細胞分選、差異microRNA表達譜檢測以及miR-449b-CCND1、E2F3通路在結(jié)腸癌干細胞自我更新的機制研究[D];復旦大學;2014年

9 辛成齊;椰棗microRNA鑒定及其在果實發(fā)育過程中的表達譜研究[D];中國科學院北京基因組研究所;2015年

10 李棟;先天性心臟病血漿microRNA表達譜及與GATA4靶序列單核苷酸多態(tài)性的關(guān)聯(lián)研究[D];山東大學;2015年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 高智紅;應用多樣性增量方法識別人類基因組microRNA前體序列[D];內(nèi)蒙古大學;2010年

2 王娜娜;microRNA進化關(guān)系及編碼特性研究[D];內(nèi)蒙古大學;2007年

3 王玫;小麥microRNA的鑒定與分析[D];南昌大學;2007年

4 秦保東;原發(fā)性膽汁性肝硬化microRNA表達譜的檢測及其功能研究[D];第二軍醫(yī)大學;2013年

5 徐嬌陽;循環(huán)microRNA用于低氧性肺動脈高壓早期診斷的實驗研究[D];石河子大學;2015年

6 余綺荷;晚期結(jié)直腸癌一線化療的臨床療效預后分析及療效相關(guān)microRNA的初步篩選[D];復旦大學;2014年

7 蔡雨函;乙型腦炎病毒的分離鑒定及其在microRNA水平上與PK-15細胞的相互作用研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學;2015年

8 葉泥;山羊地方性鼻內(nèi)腺瘤microRNA的表達差異研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學;2015年

9 李敏;活血化痰安神方對冠心病心絞痛痰瘀互結(jié)證患者臨床及microRNA研究[D];北京中醫(yī)藥大學;2016年

10 程冉;桂枝茯苓丸加味治療子宮肌瘤的療效觀察及對血清microRNA表達譜的影響[D];北京中醫(yī)藥大學;2016年

，

本文編號：2393193