【摘要】：研究背景:缺血-再灌注損傷是影響急性心梗溶栓術(shù)、血管形成術(shù)、體外循環(huán)等治療療效的瓶頸因素,導(dǎo)致這一損傷的重要原因之一是胞內(nèi)鈣超載,而胞內(nèi)鈣超載引起心肌損傷的機(jī)制并不十分清楚。文獻(xiàn)報(bào)道,胞內(nèi)鈣超載誘發(fā)心肌產(chǎn)生攣縮,繼而撕裂肌膜,加重胞外Ca2+內(nèi)流,形成惡性循環(huán),最終造成心臟功能障礙和細(xì)胞死亡。又有研究發(fā)現(xiàn),鈣反常導(dǎo)致的胞內(nèi)鈣超載可使離體細(xì)胞發(fā)生死亡。由于離體細(xì)胞不存在“攣縮性”損傷,提示其它機(jī)制參與鈣超載誘導(dǎo)的心肌損傷。鈣蛋白酶是一種存在于胞漿中的鈣離子依賴的半胱氨酸蛋白酶,研究表明,鈣超載時(shí)鈣蛋白酶轉(zhuǎn)位至肌膜并活化,鈣蛋白酶水解α-胞襯蛋白(a-fodrin)、鈉-鉀泵(Na+/K+-ATPase,NKA)等分子,引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能破壞,造成心肌損傷。由于攣縮導(dǎo)致胞外Ca2+內(nèi)流,是加重鈣超載的原因,因此,在鈣超載引起的心肌損傷過(guò)程中鈣蛋白酶與攣縮的關(guān)系亟待闡明。臨床研究發(fā)現(xiàn),心臟搭橋患者術(shù)后血清中Cl-的濃度增加幅度與房顫成正相關(guān)。基礎(chǔ)研究也觀察到,氯通道阻斷劑NPPB和SITS都能減輕缺氧-復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。表明,氯離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)異常是缺血心肌損傷的危險(xiǎn)因素,然而,這一損傷作用是否與激活鈣蛋白酶有關(guān)也不清楚,有待明確。研究目的:(1)探討鈣超載損傷時(shí)鈣蛋白酶與攣縮的關(guān)系;(2)闡明鈣蛋白酶是否參與Cl-引起的心肌損傷。研究方法:第一部分:探討鈣超載損傷時(shí)鈣蛋白酶與攣縮的關(guān)系成年清潔級(jí)Spragure-Dawley(SD)雄性大鼠,肝素化處理,脫頸處死后,迅速摘取心臟,將主動(dòng)脈根部置于Langendorff灌流系統(tǒng)上。觀察藥物對(duì)正常心臟的作用時(shí),實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分組如下:1.正常對(duì)照組:采用正常Krebs-Henseleit(KH)液灌注;2.MDL28170對(duì)照組:10mmol/L MDL28170處理8分鐘,之后恢復(fù)為正常KH液灌注;3.KB-R7943對(duì)照組:10mmol/L KB-R7943處理8分鐘,之后恢復(fù)為正常KH液灌注。在3分鐘鈣反常實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分組如下:1.鈣反常-3組:無(wú)鈣液灌注3分鐘,正常含鈣KH液灌注30分鐘;2.MDL28170+鈣反常-3組:無(wú)鈣處理之前1分鐘、無(wú)鈣期間、復(fù)鈣灌注開(kāi)始后前2分鐘,給予10mmol/LMDL28170處理;3.KB-R7943+鈣反常-3組:無(wú)鈣處理之前1分鐘、無(wú)鈣期間、復(fù)鈣灌注開(kāi)始后前2分鐘,給予10mmol/LKB-R7943處理。在5分鐘鈣反常實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分組如下:1.鈣反常-5組:無(wú)鈣液灌注5分鐘,正常含鈣KH液灌注30分鐘;2.MDL28170+鈣反常-5組:無(wú)鈣處理之前1分鐘、無(wú)鈣液灌注5分鐘期間、復(fù)鈣灌注開(kāi)始后前2分鐘,給予10mmol/LMDL28170處理;3.KB-R7943+鈣反常-5組:無(wú)鈣處理之前1分鐘、無(wú)鈣液灌注5分鐘期間、復(fù)鈣灌注開(kāi)始后前2分鐘,給予10mmol/LKB-R7943處理。各組心臟的總灌流時(shí)間相同。實(shí)驗(yàn)全程記錄左心室內(nèi)壓(LVP),左心室舒張末壓(LVEDP),以LVEDP反映攣縮狀態(tài),左心室發(fā)展壓(LVDP)反映左室收縮功能。灌流結(jié)束后行TTC染色,檢測(cè)心肌損傷面積(n=6)。復(fù)鈣后收集冠脈流出液用于檢測(cè)乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)和肌鈣蛋白(Troponin I,Tn I)的含量(n=6);在心肌組織生化實(shí)驗(yàn)中,于復(fù)鈣后2分鐘剪取心肌組織,用于檢測(cè)鈣蛋白酶活性、膜轉(zhuǎn)位以及其底物蛋白a-胞襯蛋白的降解(n=4)。第二部分:闡明鈣蛋白酶是否參與Cl-介導(dǎo)的缺血-再灌注心肌損傷成年清潔級(jí)SD雄性大鼠,肝素化處理,脫頸處死后,迅速摘取心臟,將主動(dòng)脈根部置于Langendorff灌流系統(tǒng)上。觀察藥物對(duì)正常心臟的作用時(shí),實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分組如下:1.正常對(duì)照組:采用正常KH液灌注;2.藥物對(duì)照組:分別用5mmol/L或10mmol/L NPPB與DIDS,或低氯灌注液(用葡萄糖酸置換Cl-,使KH液中的Cl-低至90 mmol/L)處理8分鐘,之后恢復(fù)為正常KH液灌注;在缺血-再灌注實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分組如下:1.缺血-再灌注組:全心缺血處理45分鐘,再灌注2小時(shí);2.氯通道阻斷劑或低氯處理組:在全心缺血之前3分鐘,再灌注開(kāi)始后前5分鐘,分別給予5mmol/LNPPB、5mmol/L DIDS或低氯處理,其他處理同缺血-再灌注組;3.MDL28170處理組:在全心缺血之前3分鐘、再灌注開(kāi)始后前5分鐘,給予10mmol/L MDL28170處理,其他處理同缺血-再灌注組。在鈣反常模型實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分組如下:1.鈣反常組:心臟依次灌注無(wú)鈣液3分鐘,正常KH液30分鐘;2.氯通道阻斷劑或低氯處理組:于無(wú)鈣液灌注之前1分鐘、無(wú)鈣液灌注期間以及正常KH液灌注開(kāi)始后前2分鐘,分別給予5mmol/LNPPB,5mmol/L DIDS或低氯處理,其他處理同鈣反常組。3.MDL28170處理組:于無(wú)鈣液灌注之前1分鐘、無(wú)鈣液灌注期間以及正常KH液灌注開(kāi)始后前2分鐘,給予10mmol/LMDL28170處理,其他處理同鈣反常組。各組心臟總灌流時(shí)間相同。實(shí)驗(yàn)全程記錄LVP與LVEDP,以LVEDP和LVDP反映左室功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)行TTC染色,測(cè)量心肌損傷面積(n=6),評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡變化:TUNEL染色和caspase-3活性檢測(cè)(n=4)。收集復(fù)灌開(kāi)始后前10分鐘或復(fù)鈣開(kāi)始后前2分鐘內(nèi)的冠脈流出液,以檢測(cè)乳酸脫氫酶含量(n=6)。在心肌組織生化實(shí)驗(yàn)中,于復(fù)灌后10分鐘或復(fù)鈣后2分鐘剪取心肌組織,以檢測(cè)鈣蛋白酶膜轉(zhuǎn)位和底物蛋白a-胞襯蛋白的降解(n=4)。研究結(jié)果第一部分:鈣反常模型中鈣蛋白和攣縮的關(guān)系1.實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),與正常對(duì)照組相比,鈣蛋白酶抑制劑MDL28170和鈉-鈣交換體抑制劑KB-R7943對(duì)正常心臟的心功能和心肌損傷面積沒(méi)有影響。2.3分鐘鈣反常處理后,LVEDP顯著抬升,LVDP消失;心肌組織幾乎全部死亡、乳酸脫氫酶大量釋放;冠脈流出液中肌鈣蛋白I的含量顯著增加;鈣蛋白酶活性明顯增強(qiáng),膜轉(zhuǎn)位增加,底物蛋白a-胞襯蛋白降解增多。3.與3分鐘鈣反常組相比,MDL28170未能降低鈣反常處理后的LVEDP,但顯著減小心肌損傷面積,減少乳酸脫氫酶的釋放,改善LVDP,并降低鈣蛋白酶活性,抑制膜轉(zhuǎn)位及a-胞襯蛋白降解的降解。KB-R7943也減弱鈣蛋白酶活性,但與MDL28170不同,KB-R7943顯著降低LVEDP,改善LVDP,同時(shí)提高細(xì)胞存活作用顯著強(qiáng)于MDL28170。4.與3分鐘的鈣反常相比,5分鐘鈣反常組的LVEDP稍有降低,差異存在顯著性,LVDP、心肌損傷面積、乳酸脫氫酶的釋放無(wú)明顯變化;鈣蛋白酶的活性增強(qiáng),a-胞襯蛋白的降解增加。5.在5分鐘鈣反常模型中,KB-R7943和MDL28170均不能降低LVEDP,不能改善LVDP,但二者仍可降低鈣蛋白酶的活性、減少膜轉(zhuǎn)位及a-胞襯蛋白的降解,減小損傷面積、減少乳酸脫氫酶的釋放。6.KB-R7943顯著減少3分鐘和5分鐘鈣反常處理中冠脈流出液肌鈣蛋白I的含量,而MDL28170則無(wú)此作用。第二部分:鈣蛋白酶在Cl-誘導(dǎo)的心肌損傷中的作用1.與正常灌注組相比,10mmol/L NPPB增加細(xì)胞死亡,而10mmol/LDIDS處理可引起不可逆的LVEDP抬升。當(dāng)濃度降低為5mmol/L時(shí),NPPB和DIDS的不良作用消失。2.與缺血-再灌注組相比,5mmol/L NPPB、5mmol/L DIDS、低氯處理均顯著減小心肌損傷面積、乳酸脫氫酶的釋放,降低減少凋亡指數(shù)和caspase-3的活性,這些作用與鈣蛋白酶抑制劑MDL28170的作用相似。心功能研究表明,DIDS和低氯處理顯著降低LVEDP,NPPB也降低LVEDP,但無(wú)顯著性差異,三種處理均可改善LVDP。3.與鈣反常組相比,5mmol/L NPPB、5mmol/L DIDS和低氯處理均顯著減小心肌損傷面積、乳酸脫氫酶的釋放,降低凋亡指數(shù)和caspase-3的活性。這些作與鈣蛋白酶抑制劑MDL28170的作用相似。心功能研究表明,三種處理均處理顯著降低LVEDP,同時(shí)伴隨LVDP的明顯改善4.MDL28170可減少缺血-再灌注或鈣反常引起的鈣蛋白酶的膜轉(zhuǎn)位,以及底物蛋白a-胞襯蛋白降解。與MDL28170的作用相似,5mmol/L NPPB、5mmol/L DIDS以及低氯處理不僅減少缺血-再灌注,還減少鈣反常所致的鈣蛋白酶膜轉(zhuǎn)位,以及底物蛋白a-胞襯蛋白降解。研究結(jié)論1.研究表明:除攣縮外,鈣蛋白酶的激活是鈣超載致心肌損傷的重要環(huán)節(jié);攣縮引發(fā)心臟功能障礙,而鈣蛋白酶參與心肌死亡的發(fā)生。2.在心肌缺血-再灌注損傷中,氯跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)異常將激活鈣蛋白酶,引起心肌損傷。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R542.2

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本文編號(hào)：2384023