發(fā)布時間：2018-12-17 09:30

【摘要】：研究背景:缺血-再灌注損傷是影響急性心梗溶栓術、血管形成術、體外循環(huán)等治療療效的瓶頸因素,導致這一損傷的重要原因之一是胞內鈣超載,而胞內鈣超載引起心肌損傷的機制并不十分清楚。文獻報道,胞內鈣超載誘發(fā)心肌產(chǎn)生攣縮,繼而撕裂肌膜,加重胞外Ca2+內流,形成惡性循環(huán),最終造成心臟功能障礙和細胞死亡。又有研究發(fā)現(xiàn),鈣反常導致的胞內鈣超載可使離體細胞發(fā)生死亡。由于離體細胞不存在“攣縮性”損傷,提示其它機制參與鈣超載誘導的心肌損傷。鈣蛋白酶是一種存在于胞漿中的鈣離子依賴的半胱氨酸蛋白酶,研究表明,鈣超載時鈣蛋白酶轉位至肌膜并活化,鈣蛋白酶水解α-胞襯蛋白(a-fodrin)、鈉-鉀泵(Na+/K+-ATPase,NKA)等分子,引起細胞結構與功能破壞,造成心肌損傷。由于攣縮導致胞外Ca2+內流,是加重鈣超載的原因,因此,在鈣超載引起的心肌損傷過程中鈣蛋白酶與攣縮的關系亟待闡明。臨床研究發(fā)現(xiàn),心臟搭橋患者術后血清中Cl-的濃度增加幅度與房顫成正相關�；A研究也觀察到,氯通道阻斷劑NPPB和SITS都能減輕缺氧-復氧誘導的心肌細胞損傷。表明,氯離子跨膜轉運異常是缺血心肌損傷的危險因素,然而,這一損傷作用是否與激活鈣蛋白酶有關也不清楚,有待明確。研究目的:(1)探討鈣超載損傷時鈣蛋白酶與攣縮的關系;(2)闡明鈣蛋白酶是否參與Cl-引起的心肌損傷。研究方法:第一部分:探討鈣超載損傷時鈣蛋白酶與攣縮的關系成年清潔級Spragure-Dawley(SD)雄性大鼠,肝素化處理,脫頸處死后,迅速摘取心臟,將主動脈根部置于Langendorff灌流系統(tǒng)上。觀察藥物對正常心臟的作用時,實驗隨機分組如下:1.正常對照組:采用正常Krebs-Henseleit(KH)液灌注;2.MDL28170對照組:10mmol/L MDL28170處理8分鐘,之后恢復為正常KH液灌注;3.KB-R7943對照組:10mmol/L KB-R7943處理8分鐘,之后恢復為正常KH液灌注。在3分鐘鈣反常實驗中,實驗隨機分組如下:1.鈣反常-3組:無鈣液灌注3分鐘,正常含鈣KH液灌注30分鐘;2.MDL28170+鈣反常-3組:無鈣處理之前1分鐘、無鈣期間、復鈣灌注開始后前2分鐘,給予10mmol/LMDL28170處理;3.KB-R7943+鈣反常-3組:無鈣處理之前1分鐘、無鈣期間、復鈣灌注開始后前2分鐘,給予10mmol/LKB-R7943處理。在5分鐘鈣反常實驗中,實驗隨機分組如下:1.鈣反常-5組:無鈣液灌注5分鐘,正常含鈣KH液灌注30分鐘;2.MDL28170+鈣反常-5組:無鈣處理之前1分鐘、無鈣液灌注5分鐘期間、復鈣灌注開始后前2分鐘,給予10mmol/LMDL28170處理;3.KB-R7943+鈣反常-5組:無鈣處理之前1分鐘、無鈣液灌注5分鐘期間、復鈣灌注開始后前2分鐘,給予10mmol/LKB-R7943處理。各組心臟的總灌流時間相同。實驗全程記錄左心室內壓(LVP),左心室舒張末壓(LVEDP),以LVEDP反映攣縮狀態(tài),左心室發(fā)展壓(LVDP)反映左室收縮功能。灌流結束后行TTC染色,檢測心肌損傷面積(n=6)。復鈣后收集冠脈流出液用于檢測乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)和肌鈣蛋白(Troponin I,Tn I)的含量(n=6);在心肌組織生化實驗中,于復鈣后2分鐘剪取心肌組織,用于檢測鈣蛋白酶活性、膜轉位以及其底物蛋白a-胞襯蛋白的降解(n=4)。第二部分:闡明鈣蛋白酶是否參與Cl-介導的缺血-再灌注心肌損傷成年清潔級SD雄性大鼠,肝素化處理,脫頸處死后,迅速摘取心臟,將主動脈根部置于Langendorff灌流系統(tǒng)上。觀察藥物對正常心臟的作用時,實驗隨機分組如下:1.正常對照組:采用正常KH液灌注;2.藥物對照組:分別用5mmol/L或10mmol/L NPPB與DIDS,或低氯灌注液(用葡萄糖酸置換Cl-,使KH液中的Cl-低至90 mmol/L)處理8分鐘,之后恢復為正常KH液灌注;在缺血-再灌注實驗中,實驗隨機分組如下:1.缺血-再灌注組:全心缺血處理45分鐘,再灌注2小時;2.氯通道阻斷劑或低氯處理組:在全心缺血之前3分鐘,再灌注開始后前5分鐘,分別給予5mmol/LNPPB、5mmol/L DIDS或低氯處理,其他處理同缺血-再灌注組;3.MDL28170處理組:在全心缺血之前3分鐘、再灌注開始后前5分鐘,給予10mmol/L MDL28170處理,其他處理同缺血-再灌注組。在鈣反常模型實驗中,實驗隨機分組如下:1.鈣反常組:心臟依次灌注無鈣液3分鐘,正常KH液30分鐘;2.氯通道阻斷劑或低氯處理組:于無鈣液灌注之前1分鐘、無鈣液灌注期間以及正常KH液灌注開始后前2分鐘,分別給予5mmol/LNPPB,5mmol/L DIDS或低氯處理,其他處理同鈣反常組。3.MDL28170處理組:于無鈣液灌注之前1分鐘、無鈣液灌注期間以及正常KH液灌注開始后前2分鐘,給予10mmol/LMDL28170處理,其他處理同鈣反常組。各組心臟總灌流時間相同。實驗全程記錄LVP與LVEDP,以LVEDP和LVDP反映左室功能。實驗結束時行TTC染色,測量心肌損傷面積(n=6),評價細胞凋亡變化:TUNEL染色和caspase-3活性檢測(n=4)。收集復灌開始后前10分鐘或復鈣開始后前2分鐘內的冠脈流出液,以檢測乳酸脫氫酶含量(n=6)。在心肌組織生化實驗中,于復灌后10分鐘或復鈣后2分鐘剪取心肌組織,以檢測鈣蛋白酶膜轉位和底物蛋白a-胞襯蛋白的降解(n=4)。研究結果第一部分:鈣反常模型中鈣蛋白和攣縮的關系1.實驗結束時,與正常對照組相比,鈣蛋白酶抑制劑MDL28170和鈉-鈣交換體抑制劑KB-R7943對正常心臟的心功能和心肌損傷面積沒有影響。2.3分鐘鈣反常處理后,LVEDP顯著抬升,LVDP消失;心肌組織幾乎全部死亡、乳酸脫氫酶大量釋放;冠脈流出液中肌鈣蛋白I的含量顯著增加;鈣蛋白酶活性明顯增強,膜轉位增加,底物蛋白a-胞襯蛋白降解增多。3.與3分鐘鈣反常組相比,MDL28170未能降低鈣反常處理后的LVEDP,但顯著減小心肌損傷面積,減少乳酸脫氫酶的釋放,改善LVDP,并降低鈣蛋白酶活性,抑制膜轉位及a-胞襯蛋白降解的降解。KB-R7943也減弱鈣蛋白酶活性,但與MDL28170不同,KB-R7943顯著降低LVEDP,改善LVDP,同時提高細胞存活作用顯著強于MDL28170。4.與3分鐘的鈣反常相比,5分鐘鈣反常組的LVEDP稍有降低,差異存在顯著性,LVDP、心肌損傷面積、乳酸脫氫酶的釋放無明顯變化;鈣蛋白酶的活性增強,a-胞襯蛋白的降解增加。5.在5分鐘鈣反常模型中,KB-R7943和MDL28170均不能降低LVEDP,不能改善LVDP,但二者仍可降低鈣蛋白酶的活性、減少膜轉位及a-胞襯蛋白的降解,減小損傷面積、減少乳酸脫氫酶的釋放。6.KB-R7943顯著減少3分鐘和5分鐘鈣反常處理中冠脈流出液肌鈣蛋白I的含量,而MDL28170則無此作用。第二部分:鈣蛋白酶在Cl-誘導的心肌損傷中的作用1.與正常灌注組相比,10mmol/L NPPB增加細胞死亡,而10mmol/LDIDS處理可引起不可逆的LVEDP抬升。當濃度降低為5mmol/L時,NPPB和DIDS的不良作用消失。2.與缺血-再灌注組相比,5mmol/L NPPB、5mmol/L DIDS、低氯處理均顯著減小心肌損傷面積、乳酸脫氫酶的釋放,降低減少凋亡指數(shù)和caspase-3的活性,這些作用與鈣蛋白酶抑制劑MDL28170的作用相似。心功能研究表明,DIDS和低氯處理顯著降低LVEDP,NPPB也降低LVEDP,但無顯著性差異,三種處理均可改善LVDP。3.與鈣反常組相比,5mmol/L NPPB、5mmol/L DIDS和低氯處理均顯著減小心肌損傷面積、乳酸脫氫酶的釋放,降低凋亡指數(shù)和caspase-3的活性。這些作與鈣蛋白酶抑制劑MDL28170的作用相似。心功能研究表明,三種處理均處理顯著降低LVEDP,同時伴隨LVDP的明顯改善4.MDL28170可減少缺血-再灌注或鈣反常引起的鈣蛋白酶的膜轉位,以及底物蛋白a-胞襯蛋白降解。與MDL28170的作用相似,5mmol/L NPPB、5mmol/L DIDS以及低氯處理不僅減少缺血-再灌注,還減少鈣反常所致的鈣蛋白酶膜轉位,以及底物蛋白a-胞襯蛋白降解。研究結論1.研究表明:除攣縮外,鈣蛋白酶的激活是鈣超載致心肌損傷的重要環(huán)節(jié);攣縮引發(fā)心臟功能障礙,而鈣蛋白酶參與心肌死亡的發(fā)生。2.在心肌缺血-再灌注損傷中,氯跨膜轉運異常將激活鈣蛋白酶,引起心肌損傷。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R542.2

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本文編號：2384023