【摘要】：研究背景:隨著科技水平的日益發(fā)展,先天性心臟病的診斷和治療水平也大幅度提高。但是復(fù)雜性先天性心臟病仍然是一個(gè)難題,死亡率居高不下。其中最常見的就是紫紺型先天性心臟病。慢性缺氧是紫紺型先天性心臟病的共同的病理生理基礎(chǔ),缺氧心肌細(xì)胞是如何完成從細(xì)胞信號傳導(dǎo)、蛋白合成到代謝的轉(zhuǎn)變,維持心肌細(xì)胞慢性缺氧代償性適應(yīng),具體機(jī)制未完全研究清楚。因此,研究慢性缺氧條件下心肌細(xì)胞的適應(yīng)機(jī)制可能對于紫紺型先天性心臟病的治療和預(yù)后有所幫助。miR-17-92基因簇為一種典型的含有多順反子啟動子的高度保守的基因簇,位于人染色體13q31.3處,C13orf25基因第3個(gè)內(nèi)含子區(qū),其轉(zhuǎn)錄前體包含了 6個(gè)串聯(lián)的莖環(huán)發(fā)卡結(jié)構(gòu),最終可產(chǎn)生 miR-17,miR-18,miR-19a,miR-20,miR-19b 和 miR-92 等6個(gè)成熟的miRNA。miR-17-92基因簇在腫瘤發(fā)生和肺、心臟、免疫器官的正常發(fā)育過程中都起著至關(guān)重要的作用。miR-17-5p屬于miR-17-92基因簇,定位于人染色體13q31,是一種編碼6個(gè)miRNA的多順反子性的miRNA。有研究發(fā)現(xiàn),miR-17-5p通過STAT3信號通路來調(diào)控骨髓抑制細(xì)胞生長(MDSC)。最新研究發(fā)現(xiàn),在心肌缺血再灌注小鼠模型和體外由H202誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激小鼠心肌細(xì)胞模型中,miR-17-5p表達(dá)增高,并且通過和STAT3的3'UTR結(jié)合,降低STAT3的表達(dá),從而促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡。許多研究顯示,IL-6-JAK-STAT3信號通路在心臟病理、生理方面具有保護(hù)的作用。之前我們的研究顯示,在心肌慢性缺氧過程中,NF-κB信號通路與SOCS3(STAT3自身誘導(dǎo)調(diào)節(jié)因子)所調(diào)控的IL-6/JAK2/STAT3信號通路的交互關(guān)系也影響著心肌傳導(dǎo)通路和心肌細(xì)胞的衰亡。因此,本實(shí)驗(yàn)主要探討心肌慢性缺氧環(huán)境下,miR-17-5p和STAT3的表達(dá)變化以及miR-17-5p對STAT3的調(diào)控對于缺氧心肌細(xì)胞凋亡的影響。研究目的:本實(shí)驗(yàn)擬在臨床心肌標(biāo)本和H9c2心肌細(xì)胞兩個(gè)水平檢測慢性缺氧條件下miR-17-5p的表達(dá)變化。在H9c2心肌細(xì)胞慢性缺氧模型中使用抑制劑和增強(qiáng)劑改變miR-17-5p的表達(dá),檢測改變miR-17-5p表達(dá)對STAT3及其下游靶基因c-myc的影響,從而對缺氧H9c2心肌細(xì)胞的影響。研究方法:1.研究臨床心肌標(biāo)本和H9c2心肌細(xì)胞兩個(gè)水平缺氧對miR-17-5p表達(dá)影響。1.1收集人心肌標(biāo)本,紫紺組病人患有法洛四聯(lián)癥,非紫紺組病人患有右室流出道狹窄合并室間隔缺損,標(biāo)本于手術(shù)中取自右室流出道。提取組織RNA,采用RT-PCR檢測miR-17-5p在兩組病人標(biāo)本中的表達(dá)情況。1.2將同一批次H9c2(大鼠心室肌細(xì)胞系)細(xì)胞置于低氧培養(yǎng)箱(1.0%O2、5.0%C02)中分別培養(yǎng)0h、12h、24h、48h及72h,對照組置于普通培養(yǎng)箱(21.0%O2)中培養(yǎng),利用RT-PCR技術(shù)檢測在心肌細(xì)胞系中隨著缺氧時(shí)間的延長miR-17-5p表達(dá)情況。2.研究miR-17-5p在H9c2細(xì)胞慢性缺氧中的作用及對STAT3信號通路的調(diào)控機(jī)制:2.1常氧時(shí)在H9c2細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染帶綠色熒光的陰性對照,通過熒光顯微鏡觀測轉(zhuǎn)染效率。2.2 向 H9c2 細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染 agomir、antagomir 和 NC,建立 agomir 組、antagomir組、對照組和空白組。2.3將轉(zhuǎn)染后的心肌細(xì)胞及空白組常氧培養(yǎng)24 h后(n=4),再缺氧培養(yǎng)48 h,通過TUNEL檢測法檢測各組心肌細(xì)胞的凋亡情況。2.4 CCK8試劑檢測缺氧0h、12h、24h、48 h各組心肌細(xì)胞的增殖情況。2.5 TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測缺氧48h后各組心肌細(xì)胞的凋亡情況。2.6 Western Blot檢測缺氧48h后各組心肌細(xì)胞內(nèi)STAT3、p-Tyr-705-STAT3及其下游調(diào)控蛋白c-myc蛋白含量。研究結(jié)果:1.與非紫紺組(0.482±0.163)相比,紫紺組(1.45±0.705)患兒心肌組織中miR-17-5p表達(dá)明顯升高(P0.01)。2.在慢性缺氧中培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞,RT-PCR結(jié)果顯示慢性缺氧0h(0.933±0.115)、12h(1.802±0.130)、24h(1.973±0.140)、48h(2.030±0.134)及 72h(2.113±0.220)時(shí) H9c2 細(xì)胞miR-17-5p表達(dá)逐漸增高(P0.01)。3.將antagomir熒光陰性對照轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞,熒光顯微鏡觀測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染效率達(dá)到75%以上。4.CCK8實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示,缺氧Oh,6h,24h,48h后,和對照組相比,上調(diào)組大鼠H9c2心肌細(xì)胞增殖明顯減少(P0.01),而下調(diào)組、空白組則無明顯差異(P0.05)5.TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示,缺氧48h后,和對照組(0.1063±0.010969)相比,上調(diào)組(0.1599±0.02016)大鼠H9c2心肌細(xì)胞明顯凋亡增加(P0.01),而下調(diào)組(0.0941±0.01913)、空白組(0.0948±0.013286)則無明顯差異(P0.05)6.miR-17-5p過表達(dá)的大鼠H9c2心肌細(xì)胞缺氧48h后,與對照組及空白組相比,STAT3,p-Tyr-705-STAT3 及其下游調(diào)控蛋白 c-myc 的表達(dá)下降(P0.01);而 miR-17-5p抑制的大鼠H9c2心肌細(xì)胞缺氧48h后,與對照組及空白組相比,STATT3,p-Tyr-705-STAT3及其下游調(diào)控蛋白c-myc的表達(dá)無明顯改變(P0.05)。結(jié)論:1.與非紫紺型患者相比,紫紺型患者心肌標(biāo)本中miR-17-5p升高3倍左右。2.H9c2心肌細(xì)胞慢性缺氧時(shí),細(xì)胞中miR-17-5p表達(dá)逐漸升高。3.H9c2心肌細(xì)胞慢性缺氧時(shí),miR-17-5p過高表達(dá)對于STAT3信號通路有明顯的抑制作用,促進(jìn)心肌凋亡,減少增生。miR-17-5p的抑制對于STAT3信號通路無明顯的改變,對心肌凋亡和心肌增生無明顯影響。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R542.2

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本文編號：2382813