【摘要】：研究背景:隨著科技水平的日益發(fā)展,先天性心臟病的診斷和治療水平也大幅度提高。但是復雜性先天性心臟病仍然是一個難題,死亡率居高不下。其中最常見的就是紫紺型先天性心臟病。慢性缺氧是紫紺型先天性心臟病的共同的病理生理基礎,缺氧心肌細胞是如何完成從細胞信號傳導、蛋白合成到代謝的轉(zhuǎn)變,維持心肌細胞慢性缺氧代償性適應,具體機制未完全研究清楚。因此,研究慢性缺氧條件下心肌細胞的適應機制可能對于紫紺型先天性心臟病的治療和預后有所幫助。miR-17-92基因簇為一種典型的含有多順反子啟動子的高度保守的基因簇,位于人染色體13q31.3處,C13orf25基因第3個內(nèi)含子區(qū),其轉(zhuǎn)錄前體包含了 6個串聯(lián)的莖環(huán)發(fā)卡結構,最終可產(chǎn)生 miR-17,miR-18,miR-19a,miR-20,miR-19b 和 miR-92 等6個成熟的miRNA。miR-17-92基因簇在腫瘤發(fā)生和肺、心臟、免疫器官的正常發(fā)育過程中都起著至關重要的作用。miR-17-5p屬于miR-17-92基因簇,定位于人染色體13q31,是一種編碼6個miRNA的多順反子性的miRNA。有研究發(fā)現(xiàn),miR-17-5p通過STAT3信號通路來調(diào)控骨髓抑制細胞生長(MDSC)。最新研究發(fā)現(xiàn),在心肌缺血再灌注小鼠模型和體外由H202誘導的氧化應激小鼠心肌細胞模型中,miR-17-5p表達增高,并且通過和STAT3的3'UTR結合,降低STAT3的表達,從而促進心肌細胞的凋亡。許多研究顯示,IL-6-JAK-STAT3信號通路在心臟病理、生理方面具有保護的作用。之前我們的研究顯示,在心肌慢性缺氧過程中,NF-κB信號通路與SOCS3(STAT3自身誘導調(diào)節(jié)因子)所調(diào)控的IL-6/JAK2/STAT3信號通路的交互關系也影響著心肌傳導通路和心肌細胞的衰亡。因此,本實驗主要探討心肌慢性缺氧環(huán)境下,miR-17-5p和STAT3的表達變化以及miR-17-5p對STAT3的調(diào)控對于缺氧心肌細胞凋亡的影響。研究目的:本實驗擬在臨床心肌標本和H9c2心肌細胞兩個水平檢測慢性缺氧條件下miR-17-5p的表達變化。在H9c2心肌細胞慢性缺氧模型中使用抑制劑和增強劑改變miR-17-5p的表達,檢測改變miR-17-5p表達對STAT3及其下游靶基因c-myc的影響,從而對缺氧H9c2心肌細胞的影響。研究方法:1.研究臨床心肌標本和H9c2心肌細胞兩個水平缺氧對miR-17-5p表達影響。1.1收集人心肌標本,紫紺組病人患有法洛四聯(lián)癥,非紫紺組病人患有右室流出道狹窄合并室間隔缺損,標本于手術中取自右室流出道。提取組織RNA,采用RT-PCR檢測miR-17-5p在兩組病人標本中的表達情況。1.2將同一批次H9c2(大鼠心室肌細胞系)細胞置于低氧培養(yǎng)箱(1.0%O2、5.0%C02)中分別培養(yǎng)0h、12h、24h、48h及72h,對照組置于普通培養(yǎng)箱(21.0%O2)中培養(yǎng),利用RT-PCR技術檢測在心肌細胞系中隨著缺氧時間的延長miR-17-5p表達情況。2.研究miR-17-5p在H9c2細胞慢性缺氧中的作用及對STAT3信號通路的調(diào)控機制:2.1常氧時在H9c2細胞系中轉(zhuǎn)染帶綠色熒光的陰性對照,通過熒光顯微鏡觀測轉(zhuǎn)染效率。2.2 向 H9c2 細胞分別轉(zhuǎn)染 agomir、antagomir 和 NC,建立 agomir 組、antagomir組、對照組和空白組。2.3將轉(zhuǎn)染后的心肌細胞及空白組常氧培養(yǎng)24 h后(n=4),再缺氧培養(yǎng)48 h,通過TUNEL檢測法檢測各組心肌細胞的凋亡情況。2.4 CCK8試劑檢測缺氧0h、12h、24h、48 h各組心肌細胞的增殖情況。2.5 TUNEL實驗檢測缺氧48h后各組心肌細胞的凋亡情況。2.6 Western Blot檢測缺氧48h后各組心肌細胞內(nèi)STAT3、p-Tyr-705-STAT3及其下游調(diào)控蛋白c-myc蛋白含量。研究結果:1.與非紫紺組(0.482±0.163)相比,紫紺組(1.45±0.705)患兒心肌組織中miR-17-5p表達明顯升高(P0.01)。2.在慢性缺氧中培養(yǎng)H9c2心肌細胞,RT-PCR結果顯示慢性缺氧0h(0.933±0.115)、12h(1.802±0.130)、24h(1.973±0.140)、48h(2.030±0.134)及 72h(2.113±0.220)時 H9c2 細胞miR-17-5p表達逐漸增高(P0.01)。3.將antagomir熒光陰性對照轉(zhuǎn)染H9c2細胞,熒光顯微鏡觀測結果顯示轉(zhuǎn)染效率達到75%以上。4.CCK8實驗檢測結果顯示,缺氧Oh,6h,24h,48h后,和對照組相比,上調(diào)組大鼠H9c2心肌細胞增殖明顯減少(P0.01),而下調(diào)組、空白組則無明顯差異(P0.05)5.TUNEL實驗檢測結果顯示,缺氧48h后,和對照組(0.1063±0.010969)相比,上調(diào)組(0.1599±0.02016)大鼠H9c2心肌細胞明顯凋亡增加(P0.01),而下調(diào)組(0.0941±0.01913)、空白組(0.0948±0.013286)則無明顯差異(P0.05)6.miR-17-5p過表達的大鼠H9c2心肌細胞缺氧48h后,與對照組及空白組相比,STAT3,p-Tyr-705-STAT3 及其下游調(diào)控蛋白 c-myc 的表達下降(P0.01);而 miR-17-5p抑制的大鼠H9c2心肌細胞缺氧48h后,與對照組及空白組相比,STATT3,p-Tyr-705-STAT3及其下游調(diào)控蛋白c-myc的表達無明顯改變(P0.05)。結論:1.與非紫紺型患者相比,紫紺型患者心肌標本中miR-17-5p升高3倍左右。2.H9c2心肌細胞慢性缺氧時,細胞中miR-17-5p表達逐漸升高。3.H9c2心肌細胞慢性缺氧時,miR-17-5p過高表達對于STAT3信號通路有明顯的抑制作用,促進心肌凋亡,減少增生。miR-17-5p的抑制對于STAT3信號通路無明顯的改變,對心肌凋亡和心肌增生無明顯影響。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R542.2

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本文編號：2382813