【摘要】：背景:急性心肌梗死(Acute mycardial infarction,AMI)是臨床急危重癥,盡管診療技術(shù)不斷發(fā)展,使得AMI的病死率有所降低,然而梗死心肌細(xì)胞無(wú)法再生,隨著后期心室重后,心肌梗死患者5年內(nèi)死亡率仍高達(dá)百分之五十。目前干細(xì)胞移植治療成為再生修復(fù)梗死心肌的新策略,其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cell,BMSCs)因其具有自我更新及有多向分化潛能,可在一定條件下被誘導(dǎo)分化為成多種成體細(xì)胞類型,成為再生修復(fù)心肌細(xì)胞的種子細(xì)胞之一。然而移植的BMSCs在梗死區(qū)域中存活率低,不能達(dá)到理想的治療效果。因此,如何提高干細(xì)胞在梗死區(qū)的存活率,是BMSCs移植治療成功的重要因素。氧化苦參堿(Oxymatrine,OMT)又名苦參素,提煉于苦參或平科植物廣豆根中的生物堿,具有抗病毒、抗炎、降壓等作用,研究發(fā)現(xiàn),OMT可通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞存活,并可調(diào)節(jié)Nrf2核轉(zhuǎn)錄上調(diào)H0-1的表達(dá),調(diào)節(jié)凋亡蛋白從而達(dá)到抗細(xì)胞凋亡的作用,但是氧化苦參堿對(duì)氧化應(yīng)激狀態(tài)下的BMSCs是否具有保護(hù)作用,PI3K/AKT信號(hào)通路的是否參與其中?目前均不清楚。目的1.明確氧化苦參堿對(duì)氧化應(yīng)激狀態(tài)下的BMSCs是否具有保護(hù)作用;2.探討氧化苦參堿對(duì)BMSCs的作用是否通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)Nrf2核轉(zhuǎn)錄及H0-1介導(dǎo)。方法:1.BMSCs的培養(yǎng)、傳代及鑒定:采用BMSCs貼壁法培養(yǎng)SD大鼠的BMSCs,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)鑒定其純度,取第3代BMSCs進(jìn)行隨后實(shí)驗(yàn);2.以不同濃度的H_2O_2(200,100,50,25,0μM)處理BMSCs2h,,行CCK8確定誘導(dǎo)BMSCs凋亡的合理濃度;3.氧化苦參堿作用濃度摸索:以不同濃度的氧化苦參堿(0.1mg/ml-0.07mg/ml)分為0.1、0.09、0.08、0.07預(yù)處理BMSCs24h后再分別加入H_2O_2(100μM)處理2h行CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力,只加完全培養(yǎng)基空白組作對(duì)照,正常組即不予H_2O_2處理,確定OMT保護(hù)BMSCs活力的最佳濃度;4.實(shí)驗(yàn)分為三組:空白組:細(xì)胞不予任何處理;H_2O_2組:只加入H_2O_2(100um)5.處理2h;OMT+H_2O_2組:予OMT(0.1mg/ml)預(yù)處理BMSCs24h再加入H_2O_2(100um)處理2h后行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組BMSCs的凋亡;Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-Caspase-3、Bax和bcl-2的表達(dá);6.實(shí)驗(yàn)分為四組:空白組:細(xì)胞不予任何處理;H_2O_2組:只加入H_2O_2(100um)處理2h;OMT+H_2O_2組:予OMT(0.1mg/ml)預(yù)處理BMSCs24h再加入H_2O_2(100um)處理2h后OMT+H_2O_2+LY294002組:予LY294002預(yù)處理BMSCs 1h后加入OMT(0.1mg/ml)處理24h,最后加入H_2O_2(100um)處理2h;行流式檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡;行Western blot檢測(cè)各組凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bax及Bcl-2的表達(dá);7.分組同5,行Western blot檢測(cè)AKT、P-AKT的磷酸化以及比較OMT對(duì)Nrf2在細(xì)胞核內(nèi)、外表達(dá)的情況以及HO-1的表達(dá);結(jié)果:1.BMSCs的培養(yǎng)、傳代及鑒定:原代BMSCs培養(yǎng)48h后,鏡下觀察細(xì)胞呈圓形亮點(diǎn)狀,4-5天時(shí)觀察BMSCs完全變?yōu)樗笮?7-8天時(shí)鏡下可見(jiàn)細(xì)胞大量增殖鋪滿整個(gè)瓶底。原代BMSCs細(xì)胞傳代培養(yǎng)到第2-3代后呈均勻分布的長(zhǎng)梭形或魚(yú)群樣細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMSCs表面標(biāo)記顯示:CD29 98.5%CD90 98.7%2.CCK8結(jié)果顯示:H_2O_2可使BMSCs活力顯著降低,100μMol/LH_2O_2為誘導(dǎo)BMSCs凋亡的合理濃度(P0.01);3.CCK8顯示H_2O_2可使BMSCs活力顯著降低,而隨著OMT處理濃度從小到大梯度的變化,其細(xì)胞活力也呈梯度增大變化,當(dāng)OMT作用濃度達(dá)0.1mg/ml時(shí)細(xì)胞活力達(dá)最大值(P0.01);4.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果:與H_2O_2組相比,OMT預(yù)處理可明顯減少由H_2O_2介導(dǎo)的BMSCs凋亡,(P0.01);Western blot檢測(cè)顯示OMT組促凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3及Bax的表達(dá)減少,抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)增高(P0.01);5.流式細(xì)胞術(shù)顯示OMT+H_2O_2+LY294002的BMSCs凋亡率和死亡率顯著升高,同時(shí)Western blot檢測(cè)Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)顯著增加,而B(niǎo)cl-2則顯著降低,與OMT+H_2O_2組相比(P0.01);Western blot檢測(cè)顯示與空白組相比,OMT預(yù)處理可使磷酸化p-AKT蛋白表達(dá)升高(P0.01);但應(yīng)用阻斷劑后磷酸化蛋白水平p-AKT較OMT組顯著降低(P0.01),與對(duì)照組相比無(wú)差異(P0.05);6.Western blot檢測(cè)檢測(cè)顯示OMT組Nrf2在細(xì)胞核的表達(dá)顯著增加,與H_2O_2組相比(P0.01),而細(xì)胞漿內(nèi),與細(xì)胞核完全相反;OMT組HO-1表達(dá)顯著增加,與H_2O_2組相比(P0.01)。結(jié)論:1.OMT對(duì)H_2O_2誘導(dǎo)的BMSCs具有抗凋亡作用,該作用是通過(guò)抑制促凋亡蛋白Caspase-3和Bax表達(dá)和上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2水平而實(shí)現(xiàn)的2.在BMSCs中OMT可能通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路,啟動(dòng)Nrf2抗氧化元件,促進(jìn)H0-1的表達(dá),進(jìn)而發(fā)揮OMT抗氧化應(yīng)激損傷保護(hù)作用;
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R54

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本文編號(hào)：2376412