【摘要】：背景近年來,心血管疾病發(fā)病率逐年升高,而基于成體干細胞治療心臟疾病的基礎(chǔ)研究為臨床應(yīng)用帶來新的契機。經(jīng)血源性子宮內(nèi)膜干細胞(Menstrual blood-derived Endometrial Stem Cells,Men ESC)具有干細胞特有的多向分化潛能,在特定誘導(dǎo)條件下可向心肌、神經(jīng)、肝臟、胰腺、肺、骨、脂肪樣細胞等分化。因此,在深入研究Men ESC生物學(xué)特性的基礎(chǔ)上,篩選安全高效的成體干細胞成心肌分化誘導(dǎo)劑,為Men ESC在心臟疾病治療中的應(yīng)用提供理論支持。目的1. 深入分析經(jīng)血源性子宮內(nèi)膜干細胞生物學(xué)特性。2.明確樣本存儲時間對經(jīng)血源性子宮內(nèi)膜干細胞生物學(xué)特性的影響。3.篩選安全高效的經(jīng)血源性子宮內(nèi)膜干細胞成心肌分化的誘導(dǎo)劑。方法1. 月經(jīng)杯收集健康女性志愿者(23-40歲)經(jīng)血樣品15 m L,與等量樣品稀釋保存液混合(含1%的青鏈霉素混合液、4%的0.25 mg/m L兩性霉素B、2%的15 g/L EDTA-Na_2),4oC儲存,并于48 h內(nèi)進行原代細胞的分離提取。MTT法和流式細胞儀檢測不同年齡志愿者經(jīng)血樣本中分離的Men ESC第3、9和18代(P3、P9及P18代)細胞增殖活性和成體干細胞表面標志的表達;將P3代Men ESC和小鼠嗜鉻細胞瘤細胞株P(guān)C12注射入裸鼠皮下,檢測Men ESC的致瘤性;將Di I標記的Men ESC經(jīng)小鼠尾靜脈注射72 h后取出肝、脾、肺和腎,經(jīng)4%多聚甲醛固定,常規(guī)包埋后冰凍切片觀察Men ESC在各器官分布。2.收集志愿者經(jīng)血樣本,同一經(jīng)血樣本平均分為三份,4oC儲存6 h、24 h及72 h后采用密度梯度離心法分離培養(yǎng)Men ESC,HE染色及結(jié)晶紫染色法觀察原代細胞形態(tài)及克隆形成;待培養(yǎng)至P3代時進行成脂成骨誘導(dǎo)和染色,MTT法檢測增殖活性,流式細胞分析儀檢測成體干細胞表面標志物表達。3.通過MTT法和劃痕實驗檢測淫羊藿苷(Icariin,ICA)、丹酚酸B(salvianolic acid B Sal B)對P3代Men ESC增殖和遷移活性的影響;RT-PCR檢測ICA、5氮雜胞苷(5azacytidine 5aza C)誘導(dǎo)前后心肌特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子MEF-2C、Nkx2.5、GATA4以及心肌特異性標志物心房鈉尿肽(h ANP)、肌鈣蛋白I(c Tn I)、肌鈣蛋白T(c Tn T)的基因表達水平;最后進一步利用免疫細胞熒光的方法檢測ICA、5aza C誘導(dǎo)后細胞中c Tn T在蛋白質(zhì)水平的表達變化。結(jié)果1. 所分離培養(yǎng)的Men ESC陽性表達成體干細胞表面標志物CD29、CD44、CD73、CD90、CD105,陰性表達造血細胞標志表面標志物CD45和CD34,并且陽性表達HLA-ABC,陰性表達HLA-DR;供體年齡和細胞傳代次數(shù)對Men ESC的增殖能力影響呈負相關(guān)。細胞隨著供體年齡和傳代次數(shù)的增加對Men ESC成脂分化沒有明顯影響。裸鼠接種PC12細胞一周后可明顯觀察到瘤體形成,生存期不超過12周;而接種Men ESC的裸鼠至12周后仍未觀察到瘤體形成;Di I標記的Men ESC經(jīng)尾靜脈注射72 h后,主要滯留在肺臟和肝臟,少數(shù)出現(xiàn)在脾臟和腎臟。2.經(jīng)血樣本體外4oC保存6 h、24 h及72 h后,所分離獲得的三組原代Men ESC培養(yǎng)7 d后,HE染色結(jié)果顯示多數(shù)細胞呈長而扁平的梭形,細胞集落成旋渦狀生長,形態(tài)均一,排列較為整齊,結(jié)晶紫染色后均可見明顯細胞克隆。且獲得的Men ESC培養(yǎng)相同時間后檢測其細胞數(shù)量各組之間沒有明顯差異。三組P3代Men ESC經(jīng)成脂或成骨誘導(dǎo)21 d后,均可見明顯的脂滴和鈣沉淀;在培養(yǎng)3 d、5 d及7 d后MTT法檢測其增殖活性,分析表明三組細胞的增殖活性無統(tǒng)計學(xué)差異。流式分析結(jié)果表明:CD29、CD44、CD73、CD90及CD105五種常用成體干細胞表面標志物,在上述三組P3代Men ESC上的陽性表達率均高于95%,且各組表達無明顯差異。3.ICA在濃度為10~(-6) mol/L和10~(-7 )mol/L時對Men ESC增殖和遷移無明顯影響;而Sal B對Men ESC增殖和遷移均有抑制作用,因此選用ICA為理想的誘導(dǎo)Men ESC成心肌分化的誘導(dǎo)劑。進一步RT-PCR結(jié)果顯示經(jīng)ICA、5aza C誘導(dǎo)后的Men ESC均能顯著上調(diào)MEF-2C、Nkx2.5、GATA4、h ANP、c Tn I及c Tn T基因的表達,而最終的免疫熒光結(jié)果也證實ICA誘導(dǎo)后的Men ESC陽性表達c Tn T。結(jié)論1. 所分離得到的Men ESC符合對成體干細胞的鑒定標準,進一步明確了Men ESC的生物學(xué)特性。2.從體外4oC存儲72 h內(nèi)經(jīng)血樣本中均可成功分離獲得Men ESC,且對所分離獲得的Men ESC生物學(xué)特性沒有明顯影響。3.ICA在不影響Men ESC增殖和遷移活性的基礎(chǔ)上促進其成心肌樣細胞分化。
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【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R54

【參考文獻】

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1 嚴琰;東健灃;桑運霞;劉召青;齊念民;;經(jīng)血源子宮內(nèi)膜干細胞培養(yǎng)、鑒定及體外分化潛能的研究[J];中國細胞生物學(xué)學(xué)報;2014年07期

2 井樂剛;喬靜;路芳;甄鑫;盧Z，

本文編號：2369054