【摘要】：隨著分子生物學(xué)進(jìn)展特別是人類基因組研究的發(fā)展,越來越多的遺傳性出血性疾病的分子機(jī)制被闡明,這對于深入探討血小板的病理生理意義以及結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系具有重要的意義�；蛟\斷也成為今后遺傳性出血性疾病研究的發(fā)展的主要方向。巨大血小板綜合征(Bernard-Soulier syndrome,BSS)是一種罕見的先天性遺傳性血小板疾病,主要是由于血小板膜糖蛋白GPIb和GPIX質(zhì)或量的缺陷所致。以出血時間延長、血小板數(shù)量減少、血小板體積巨大為特征。血小板無力癥(Glanzmann thrombasthenia,GT)是以血小板膜上整合素αIIbβ3的質(zhì)和(或)量的缺陷為特征的一種常染色體隱性遺傳性疾病,表現(xiàn)為血小板對多種生理性誘聚劑反應(yīng)低下或缺如。先證者通常是因為自幼有不能解釋的出血傾向而就診,這些出血程度表現(xiàn)各異,常被漏診或誤診,因此,詳盡的臨床檢查和基因檢測是正確診療的前提。在我們的臨床研究中,對上述13例先證者進(jìn)行表型診斷、基因分析、功能檢測和體外細(xì)胞實驗,以探究其分子發(fā)病機(jī)制。用血小板聚集儀檢測所有先證者不同誘導(dǎo)劑的血小板聚集率;流式細(xì)胞術(shù)檢測患者血小板的GPIbα、GPIbβ、GPIX、GPIIb、GPIIIa的陽性百分率和熒光強(qiáng)度;提取先證者及其家系成員外周血DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增GPIbα、GPIbβ、GPIX、GPⅡb和GPIIIa五種基因全長編碼序列,PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行DNA測序分析;構(gòu)建突變型質(zhì)粒,用含有野生型或突變型全長編碼序列的質(zhì)粒對中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞共轉(zhuǎn)染;流式細(xì)胞術(shù)檢測患者共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞的GPIbα、GPIbβ、GPIX、GPIIb與GPIIIa陽性百分率和熒光強(qiáng)度;應(yīng)用免疫印跡分析轉(zhuǎn)染后CHO細(xì)胞胞漿中GPIb-GPIX復(fù)合物GPIIb IIIa復(fù)合物的表達(dá);進(jìn)行PCR擴(kuò)增FLNA基因;免疫熒光法檢測FLNA在血小板鋪展過程中的表達(dá)及分布;Western blot檢測FLNA、Sky與Syk-P在靜息狀態(tài)下血小板聚集過程中的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),3例BSS先證者中,血小板對瑞斯托霉素誘導(dǎo)的聚集顯著降低(范圍,0%-3.5%;平均值1.2%),其中先證者2對低濃度膠原誘導(dǎo)的血小板聚集率明顯減少;流式檢測顯示血小板表面膜糖蛋白GPIbα表達(dá)量嚴(yán)重降低(范圍,0.5%-7.1%;平均值,3.2%);10例GT先證者中,血小板對ADP誘導(dǎo)的聚集反應(yīng)明顯低下,部分缺失(范圍,0%-20.9%,平均值6.1%);流式檢測顯示血小板表面膜糖蛋白GPIIb IIIa復(fù)合物的表達(dá)量嚴(yán)重下降:GPIIb(范圍,0.1%-98.7%;平均值,19.6%),GPIIIa(范圍,0.3%-100%;平均值56.1%)。其中1例GT先證者GPIIb IIIa表達(dá)大于50%,然而,血小板與纖維蛋白原的結(jié)合能力明顯低下,相當(dāng)于正常對照的14%。通過基因測序,我們共發(fā)現(xiàn)有15種突變,其中錯義突變8種、無義突變2種和剪切子突變5種。15種突變中,1種突變發(fā)生FLNA基因,2種突變發(fā)生在IBA基因,2種突變發(fā)生在β3基因,10種突變發(fā)生在αII b基因。我們對其中的GPIbα基因987GA,GPIbα基因1480 del A和GPIIIa 719GA進(jìn)行了CHO細(xì)胞共轉(zhuǎn)染實驗,瞬時轉(zhuǎn)染突變型GPIbα987 GA質(zhì)粒的CHO細(xì)胞膜上GPIbα表達(dá)顯著減少但在CHO細(xì)胞胞漿中發(fā)現(xiàn)豐富的截短蛋白;瞬時轉(zhuǎn)染突變型GPIbα1480 del A質(zhì)粒的CHO細(xì)胞膜上未見GPIbα的表達(dá),但GPIX在CHO細(xì)胞胞膜上的表達(dá)率為陽性對照的18%;穩(wěn)定轉(zhuǎn)染突變型GPIIIa 719GA質(zhì)粒的CHO細(xì)胞膜上GPIIb IIIa表達(dá)較正常對照差異不顯著并大量存在于細(xì)胞胞漿中。另外,先證者2 FLNA蛋白在血小板胞漿內(nèi)的表達(dá)量與正常人無顯著差別(P0.01),免疫熒光共定位實驗中發(fā)現(xiàn)FLNA蛋白能夠與GPIIIa共定位,且FLNA蛋白分布正常。在研究低濃度Convulxin誘導(dǎo)血小板聚集的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中,我們發(fā)現(xiàn)Syk-P的表達(dá)量顯著降低(P0.01)。本項實驗證明先證者2低濃度膠原誘導(dǎo)血小板聚集缺陷與FLNA基因的1582GA雜合突變相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R554

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2342645