【摘要】：目的：微血管是心臟終末循環(huán)的末梢,決定了組織灌注水平和氧供平衡。心梗缺血后的再灌注時(shí)期產(chǎn)生的大量活性氧(Reactive oxygen species, ROS)是誘導(dǎo)冠脈末梢的CMEC (Cardiac Microvascular Endothelial Cells, CMEC)凋亡的主要因素之一。前期研究證實(shí),黃嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase, XO)是CMEC在氧化應(yīng)激條件下產(chǎn)生ROS的主要來(lái)源之一。如何減少CMEC的氧化應(yīng)激損傷是防治急性心肌梗死再灌注損傷的重點(diǎn)。胰高血糖素樣肽-1(glucagon-likepeptide-1, GLP-1)近期被發(fā)現(xiàn)在心臟組織中具有抗氧化應(yīng)激的作用。故本研究旨在探究GLP-1類似物利拉魯肽(GLP-1 Analogue, Liraglutide)對(duì)CMEC生物學(xué)特性的影響,以及缺氧復(fù)氧模型(Hypoxia/Reoxygenation Model, H/R)條件下,Liraglutide保護(hù)CMEC免受氧化應(yīng)激損傷的具體機(jī)制,以及提高CMEC的存活能力的分子信號(hào)通路的研究。方法：雙酶消化法體外分離培養(yǎng)SD大鼠CMEC,差速貼壁法進(jìn)行純化,CD31和Ⅷ因子抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定CMEC純度,CD31和GLP-1R抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)共染細(xì)胞。采用不同濃度Liraglutide (0-100 nM)預(yù)干預(yù)后MTT繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，BrdU熒光標(biāo)記法和劃痕實(shí)驗(yàn)觀察藥物作用下細(xì)胞增殖和遷移能力。建立H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激凋亡模型,流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,DCFHDA熒光探針檢測(cè)胞內(nèi)ROS的變化,Fura-3 AM熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子變化,免疫熒光染色和Western Blot檢測(cè)XO、caspase3等蛋白分子的表達(dá)情況，利用通路阻斷劑和干擾RNA技術(shù),闡明Liraglutide通過(guò)激活PI3K/Akt-Survivin分子信號(hào)在抗細(xì)胞氧化應(yīng)激過(guò)程中的保護(hù)作用機(jī)制。結(jié)果：1.體外分離SD乳鼠原代CMEC,72 h后細(xì)胞呈典型“鋪路石樣”生長(zhǎng),CD31及Ⅷ因子免疫熒光染色提示雙陽(yáng)性率大于95%,說(shuō)明CMEC純度較高。2.CD31和GLP-1R抗體免疫熒光共定位染色提示CMEC表達(dá)GLP-1受體,MTT示Liraglutide以濃度依賴方式促進(jìn)CMEC的體外增殖,100 nM為其最適生長(zhǎng)濃度。3.予以Liraglutide預(yù)處理細(xì)胞24h,BrdU和劃痕實(shí)驗(yàn)均說(shuō)明Liraglutide能以濃度依賴性促進(jìn)CMEC的增殖和遷移能力。4.通過(guò)缺氧4h復(fù)氧4h成功建立H/R模型，在該模型條件下可以顯著提高胞漿ROS含量、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡：而Liraglutide預(yù)處理細(xì)胞12h可以通過(guò)降低ROS、進(jìn)而減少凋亡細(xì)胞數(shù)量。5.H/R模型誘導(dǎo)黃嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase, XO)表達(dá)增加,生成過(guò)量ROS及增加凋亡蛋白的表達(dá)。利用siRNA敲低XO或予以Liraglutide預(yù)處理可顯著降低胞漿ROS水平，同時(shí)降低凋亡蛋白的表達(dá)。6.H/R模型條件導(dǎo)致細(xì)胞胞漿鈣超載,誘導(dǎo)XO表達(dá)增加,生成過(guò)量ROS及凋亡蛋白的表達(dá)。使用BAPTA中和鈣離子或Liraglutide預(yù)處理12 h可明顯減少XO表達(dá),降低胞漿ROS水平,同時(shí)降低凋亡蛋白的表達(dá)。7.H/R模型誘導(dǎo)過(guò)量胞漿XO-ROS生成,最終導(dǎo)致了線粒體膜電位降低、細(xì)胞色素c向胞漿滲漏,線粒體凋亡通路的激活。Liraglutide預(yù)處理12h或敲低XO可以在一定程度上逆轉(zhuǎn)線粒體膜電位的丟失和細(xì)胞色素c向胞漿的滲漏,從而促進(jìn)細(xì)胞存活。8.H/R模型通過(guò)下調(diào)SERCA2a、促進(jìn)IP3R轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣通道失衡、誘導(dǎo)胞漿鈣超載,從而升高XO的表達(dá)以及胞漿ROS的含量。阻斷IP3R、鰲合胞漿鈣、使用siRNA敲低XO,可以有效降低胞漿ROS水平，同時(shí)降低caspase3的表達(dá);Liraglutide預(yù)處理12h恢復(fù)SERCA2a的轉(zhuǎn)錄水平并下調(diào)IP3R的轉(zhuǎn)錄,抑制了H/R誘導(dǎo)的鈣失衡、XO的激活,最終降低胞漿過(guò)量ROS并提高細(xì)胞存活。9. Liraglutide預(yù)處理12 h，，CMEC中p-Akt及survivin表達(dá)量升高,給與PI3K/Akt阻斷劑LY294002后,survivin的表達(dá)下降。10.H/R模型中分別阻斷PI3K/Akt、敲低survivin或阻斷GLP-1R,均可以降低Liraglutide對(duì)SERCA2a和IP3R轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)作用,誘發(fā)了下游鈣離子失衡、過(guò)量ROS生成,及凋亡蛋白表達(dá)增加。11. Liraglutide通過(guò)提高SOD、GSH和GPx的含量，維持胞內(nèi)正常ROS水平。結(jié)論：1. Liraglutide是以濃度依賴方式通過(guò)激活胞內(nèi)PI3K/Akt和MAPK/ERK通路促進(jìn)原代大鼠CMEC的增殖和遷移。2.H/R模型通過(guò)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣超載誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,導(dǎo)致?lián)p傷軸SR-Ca2+-XO-ROS激活，生成過(guò)量胞漿ROS,最終介導(dǎo)了CMEC的線粒體凋亡通路激活，而予以Liraglutide預(yù)處理可以逆轉(zhuǎn)上述過(guò)程。3. Liraglutide既能夠通過(guò)提高SOD、GSH和GPx維持正常的胞內(nèi)ROS水平,又可以通過(guò)激活GLP-1 R/PI3K/Akt/survivin通路進(jìn)而促進(jìn)SERCA2a的表達(dá)和活性,最終降低鈣超載引起的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,促進(jìn)細(xì)胞存活。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R54

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本文編號(hào)：2320333