【摘要】：延遲整流鉀電流(IK)是哺乳動物和人的心室肌細胞動作電位復極主要的外向鉀電流,按照通道動力學特征將IK區(qū)分為快激活(IKr)和緩慢激活IKs)兩種成分。其中,IKs通道的孔區(qū)α-亞單位由KCNQ1基因編碼、β-亞單位由KCNE1基因編碼�，F已明確,先天性KCNQ1和KCNE1基因突變可致IKs增大或減小,分別引發(fā)長QT綜合征(LQT)和短QT綜合征(SQT)。心臟疾病如心肌缺血、心肌肥厚、慢性心力衰竭等均伴隨IKs的減小,表現為獲得性LQT。LQT和SQT均以高發(fā)室性心律失常為特征。因此,研究KCNQ1/KCNE1通道的功能調節(jié)具有重要意義。越來越多的證據表明,催化磷酸化反應的蛋白磷酸激酶C(protein kinase C,PKC)家族與KCNQ1/KCNE1通道的功能調控相關,但迄今關于PKC對IKs的調節(jié)報道不盡相同,有增加和減小兩種相反的結果。已知PKC家族按照結構和激活方式的不同可以分為傳統(tǒng)型PKC(c PKC,包括α、βI、βII和γ),新型PKC(n PKC,包括δ、ε、π和θ)和非典型PKC(a PKC,包括ζ、i/λ)三大類,而不同動物種屬的心肌組織均存在PKCα、βI、βII、e、θ、δ、γ等亞型。很可能上述PKC對IKs的不同調節(jié)現象是因為激活的PKC亞型不同所致。離子通道電流的大小取決于通道孔的通透性、開放概率以及細胞膜上通道數量,調節(jié)后者的因素涉及基因轉錄、蛋白合成、轉運以及降解等環(huán)節(jié)。其中蛋白的正向轉運與降解平衡是決定細胞膜上通道數量的關鍵環(huán)節(jié),目前,不同PKC亞型如何調控細胞膜通道蛋白轉運與降解從而影響細胞膜上通道數量尚不清楚。因此,本研究主要在分子生物學水平,利用非選擇性PKC激動劑和連接透膜序列的選擇性PKC激動肽,在異源表達系統(tǒng)上研究不同PKC亞型對細胞膜上KCNQ1表達水平的調節(jié)作用,并且探究其調節(jié)作用的機制。這對理解心肌離子通道的病理重構機制具重要意義,也將為發(fā)現以PKC亞型為靶點的新型抗心律失常藥物提供重要的理論依據。第一部分不同PKC亞型對KCNQ1蛋白表達調節(jié)作用。目的:在構建的穩(wěn)定表達KCNQ1/KCNE1通道的HEK293細胞系上,研究不同PKC亞型對KCNQ1總蛋白、細胞膜蛋白表達水平的影響。方法:1全細胞蛋白提取:細胞漂洗后輕輕刮下并離心,收集細胞沉淀,按照RIPA裂解液與蛋白酶抑制劑(PMSF)以100:1的比例加入并使細胞沉淀充分混懸,冰上超聲破碎后靜置裂解,離心收集上清液。2細胞膜蛋白提取:利用生物素�；姆椒擞浖毎さ鞍�,充分裂解破碎細胞后,借助珠子特異性結合的方式將生物素標記的膜蛋白分離,其余成份離心丟棄,再經洗脫,得到純凈的細胞膜蛋白成份。3 Western blot:對提取的全細胞蛋白或者細胞膜蛋白進行SDS-PAGE電泳,經濕轉法轉移到PVDF膜上,用TBST配制含10%脫脂奶粉的封閉液進行封閉,通過特異性的一抗與紅外熒光標記的二抗結合,用ODYSSEY雙色紅外激光成像系統(tǒng)儀器進行曝光成像。4 si RNA瞬時轉染:采用Lipofectin RNAmax試劑盒進行瞬時轉染,鋪板后24小時,細胞匯合度達到50%-60%時可進行si RNA的瞬時轉染。轉染4小時左右后換完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48小時后,si RNA表達完成,可進行下一步處理。結果:1不同PKC亞型對全細胞KCNQ1蛋白表達水平的影響:利用非選擇性PKC激動劑PMA(100 n M)、OAG(10μM)和選擇性c PKC激動肽(200 n M)、PKCε激動肽(200 n M)分別孵育24小時,Western blot檢測全細胞KCNQ1蛋白表達沒有明顯變化(P0.05)。2不同PKC亞型對細胞膜KCNQ1蛋白表達水平的影響:首先,驗證細胞膜蛋白提取方法的敏感性。采用陽性對照藥地塞米松(50 n M)(已被證實通過抑制蛋白泛素化降解,顯著增加細胞膜KCNQ1蛋白表達水平)孵育6、24小時后,與對照組相比,細胞膜KCNQ1蛋白表達水平分別是對照的176%(P0.05)和281%(P0.05),證明實驗所用的細胞膜蛋白提取方法敏感性較好。PMA、OAG以及c PKC激動肽、PKCε激動肽分別與細胞孵育6、24小時,Western blot檢測細胞膜KCNQ1蛋白表達水平。結果顯示,PMA孵育后細胞膜KCNQ1蛋白表達水平分別是對照的36%(P0.01)和24%(P0.01);c PKC激動肽孵育后,細胞膜KCNQ1蛋白表達水平分別是對照的24%(P0.01)和30%(P0.01);PKCε激動肽孵育后細胞膜KCNQ1蛋白表達水平是對照的34%(P0.01)和34%(P0.01);而OAG孵育后,細胞膜KCNQ1蛋白表達水平沒有明顯變化(P0.05)。3 si RNA敲低不同PKC亞型對激動肽作用的影響:利用si RNA干擾技術,敲低不同PKC亞型表達,觀察對上述PKC亞型激動肽作用的影響,進一步驗證其作用的特異性。結果顯示,敲低細胞PKCa和β亞型可逆轉c PKC激動肽下調細胞膜KCNQ1蛋白表達的作用(P0.05),未敲低為對照的48%,而敲低PKCa和β亞型后為對照的94%。與此相似,敲低PKCε亞型后PKCε激動肽對細胞膜KCNQ1蛋白表達的下調作用顯著減弱(P0.01),未敲低為對照的33%,而敲低PKCε亞型后為對照的68%。因此,實驗進一步表明PKC亞型特異性調節(jié)細胞膜KCNQ1蛋白表達的作用。小結:在異源表達系統(tǒng)上,PMA、c PKC和PKCε激動肽對全細胞KCNQ1蛋白表達無明顯影響,而對細胞膜KCNQ1蛋白表達均呈現明顯下調作用,提示PKC通過調節(jié)通道的轉運與降解過程影響細胞膜上的通道表達水平。第二部分不同PKC亞型對細胞膜KCNQ1表達調節(jié)作用的機制目的:探究激活c PKC亞型和PKCε亞型后下調細胞膜KCNQ1蛋白表達的調節(jié)作用機制。方法:觀察選擇性干擾細胞膜通道蛋白內吞、降解和正向轉運過程的工具藥對PKC亞型激動肽作用的影響,分析激活不同PKC亞型對上述過程的調節(jié)作用。細胞膜蛋白提取和Western blot方法同第一部分。結果:1對細胞膜蛋白內吞過程影響:觀察內吞抑制劑Dynasore(80μM)對激活不同PKC亞型作用的影響。結果顯示,PMA與Dynasore共同孵育6小時后對細胞膜KCNQ1蛋白表達的下調作用被明顯抑制(P0.01),單獨孵育表達水平為對照的34%,而共同孵育為對照的89%;與此相似,c PKC激動肽與Dynasore共同孵育對細胞膜KCNQ1蛋白表達的下調作用同樣被明顯抑制(P0.01),單獨孵育表達水平為對照的24%,而共同孵育為對照的89%。上述結果表明PMA和c PKC激動肽通過促進馬達蛋白介導的內吞途徑使細胞膜KCNQ1蛋白加速降解而發(fā)揮下調作用。與此相反,PKCε激動肽與Dynasore共同孵育對KCNQ1細胞膜蛋白表達的下調作用未受影響(P0.05),單獨孵育表達水平為對照的29%,而共同孵育表達水平為對照的39%,提示PKCε激動肽并非通過影響內吞過程減少細胞膜KCNQ1表達水平。此外,單獨孵育Dynasore并不明顯改變細胞膜KCNQ1蛋白表達水平,可能是其他代償的方式彌補了馬達蛋白介導的內吞途徑阻斷所帶來的影響。2對細胞膜蛋白降解的影響:加入正向轉運阻斷劑Brefeldin A(BFA)(10μM)后利用Western blot檢測不同時間細胞膜上KCNQ1蛋白表達水平,可以反映出通道細胞膜蛋白降解速度。結果顯示,以各自0小時細胞膜KCNQ1蛋白表達水平為100%,BFA對照組孵育6、24小時分別是0小時的72%和39%,c PKC激動肽共孵育分別是30%和14%,與對照相比降解顯著增多(P0.01);而PKCε激動肽共孵育分別是68%和33%,降解程度與對照相比無明顯差別(P0.05)。結果進一步驗證了激活c PKC亞型通過加速內吞降解過程下調細胞膜KCNQ1蛋白表達水平,而激活PKCε亞型對細胞膜KCNQ1蛋白表達的下調作用則可能是通過抑制蛋白正向轉運或者再循環(huán)過程而實現的。與此類似,我們也觀察了PMA對蛋白降解的影響。結果顯示,BFA對照組孵育后細胞膜KCNQ1蛋白表達水平分別是0小時的82%和32%,而PMA共孵育分別是45%和14%,兩個時間點的降解程度均顯著高于對照(P0.01),表明PMA也通過加速內吞降解過程來下調細胞膜KCNQ1蛋白表達水平。結果提示盡管PMA為非選擇性PKC激動劑,但其作用機制與c PKC亞型相似,可能在此實驗系統(tǒng)PMA主要通過激活c PKC亞型下調細胞膜KCNQ1蛋白表達水平。小結:PMA和c PKC激動肽加速了通道細胞膜蛋白的內吞降解,而PKCε激動肽則可能抑制了蛋白正向轉運或者再循環(huán)過程降低細胞膜KCNQ1蛋白表達量。結論:在異源表達系統(tǒng)上,c PKC與PKCε亞型均可顯著降低細胞膜KCNQ1蛋白表達水平,其機制是c PKC亞型加速蛋白內吞、降解過程,而PKCε亞型不影響此過程,可能是其抑制蛋白正向轉運或者再循環(huán)過程。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R54

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本文編號：2319795