【摘要】：背景:血管緊張素產(chǎn)生于肝臟,經(jīng)體內(nèi)轉(zhuǎn)化后形成血管緊張素Ⅱ(Ang-Ⅱ),其受體廣泛分布于人體的血管內(nèi)皮上。Ang-Ⅱ作用于內(nèi)皮細(xì)胞后,產(chǎn)生大量活性氧(ROS),ROS的大量累積引起的氧化應(yīng)激可導(dǎo)致細(xì)胞損傷,尤其是早期表現(xiàn)為對(duì)線粒體的影響;氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮線粒體的損傷及功能障礙,是動(dòng)脈血管粥樣硬化產(chǎn)生的早期階段。Ang-Ⅱ作為目前最強(qiáng)大的血管收縮的活性物質(zhì)之一,廣泛存在于血管平滑肌上;且其在血管內(nèi)可與其表面受體結(jié)合,來(lái)介導(dǎo)ROS信號(hào)的通路傳導(dǎo):誘導(dǎo)Rac及P40向細(xì)胞膜移動(dòng),激活還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的氧化反應(yīng),促進(jìn)ROS產(chǎn)生。適量的ROS可上調(diào)存活途徑,進(jìn)而增強(qiáng)相關(guān)抗氧化應(yīng)激基因的表達(dá);隨著ROS濃度的升高,可誘導(dǎo)線粒體DNA損傷,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。線粒體的早期損傷主要表現(xiàn)為調(diào)節(jié)及組成線粒體的生物合成蛋白減少。其中,線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)作為線粒體轉(zhuǎn)錄及復(fù)制的關(guān)鍵激活因子及調(diào)節(jié)因子,在氧化應(yīng)激中起重要作用。TFAM是在細(xì)胞核中產(chǎn)生并轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞線粒體內(nèi);作為調(diào)控因子可調(diào)節(jié)線粒體DNA的轉(zhuǎn)錄、翻譯和合成后的修飾;在心力衰竭、心肌缺血引起的再灌注損傷等氧化應(yīng)激下,TFAM作為保護(hù)因子可對(duì)抗活性氧引起的細(xì)胞線粒體損傷。TFAM作為核基因編碼的一種小分子多肽,可維護(hù)線粒體DNA的完整性,從而抑制細(xì)胞凋亡。正常機(jī)體中氧化應(yīng)激損傷時(shí),TFAM增加的表達(dá)量,可導(dǎo)致線粒體的含量增加,線粒體的膜電位增高及凋亡量減少。有研究顯示細(xì)胞受到氧化應(yīng)激時(shí),細(xì)胞內(nèi)的G蛋白偶聯(lián)—CAMP反應(yīng)原件結(jié)合蛋白(PKA-CREB)通路激活,上調(diào)過(guò)氧化物酶體增生物激活受體r共激活因子(PGC-1α)、核呼吸因子-1(NRF-1)的表達(dá)量,進(jìn)而增加TFAM的表達(dá)量;TFAM與線粒體DNA的親和力增加,調(diào)節(jié)線粒體DNA的拷貝數(shù),維護(hù)線粒體DNA的完整和穩(wěn)定,促進(jìn)線粒體DNA的損傷修復(fù)。然而,隨著氧化應(yīng)激產(chǎn)物的異常積累會(huì)損傷細(xì)胞核DNA的功能導(dǎo)致TFAM的表達(dá)量降低。有研究顯示可能與細(xì)胞自身的負(fù)反饋相關(guān),細(xì)胞在受到ROS刺激后,線粒體內(nèi)TFAM的含量增加導(dǎo)致核內(nèi)的TFAM與NRF-1結(jié)合形成免疫共沉淀,導(dǎo)致NRF-1的表達(dá)量降低,進(jìn)而引起細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的TFAM表達(dá)量降低,同時(shí)有研究顯示,細(xì)胞質(zhì)中Lon蛋白水解酶可以使磷酸化的TFAM裂解,高濃度的ROS抑制HSP60-70-TFAM-Lon復(fù)合物的形成,從而抑制線粒體的生物合成。因此,Ang-Ⅱ作用于內(nèi)皮細(xì)胞,細(xì)胞的功能變化尚需進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)探討不同濃度的Ang-Ⅱ作用于內(nèi)皮細(xì)胞,觀察細(xì)胞TFAM的表達(dá)及細(xì)胞功能變化,為進(jìn)一步早期檢測(cè)和防治動(dòng)脈粥樣硬化提供理論依據(jù)。目的:探討血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)的表達(dá)情況及細(xì)胞功能的影響。方法:1細(xì)胞來(lái)源:本實(shí)驗(yàn)采用原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)(Scien Cell公司)。2實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù):收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs細(xì)胞,調(diào)至1x106/m L接種于6孔板培養(yǎng)12小時(shí),加入藥物終濃度為10-7、10-6、10-5mol/L的Ang-Ⅱ作為實(shí)驗(yàn)組(分別為B、C、D組),對(duì)照組(A組)不加藥物。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均培養(yǎng)于不加血清的培養(yǎng)基中。3采用蛋白印跡(Western-blot)技術(shù),檢測(cè)各組細(xì)胞TFAM在蛋白水平的表達(dá)差異。4采用實(shí)時(shí)熒光半定量技術(shù)(RT-PCR),檢測(cè)各組細(xì)胞TFAM在基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)差異。5采用流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位、細(xì)胞凋亡率。6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析:應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用單因素方差分析比較多組數(shù)據(jù),P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1不同濃度Ang-Ⅱ作用于HUVECs TFAM蛋白、TFAMm RNA的表達(dá)水平不同濃度的Ang-Ⅱ(0,10-7,10-6,10-5mol/L)作用于細(xì)胞24小時(shí)后,各組TFAM蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.94±0.04、0.78±0.09、0.48±0.09、0.40±0.07,實(shí)驗(yàn)組蛋白表達(dá)量均較對(duì)照組減少,具有一定的濃度依賴(lài)性,B、C、D組蛋白相對(duì)表達(dá)量與A組相比,P均0.01;同時(shí)A、B、C、D組TFAM m RNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.94±0.08、0.78±0.09、0.44±0.07、0.40±0.08,與TFAM蛋白的表達(dá)水平相似,B、C、D組TFAM m RNA相對(duì)表達(dá)量與A組相比,P均0.01。2各組細(xì)胞膜電位檢測(cè)JC-10發(fā)射出紅色熒光,在線粒體內(nèi)的存在形式為多聚體;細(xì)胞發(fā)生早期凋亡前,線粒體膜電位就出現(xiàn)下降情況,導(dǎo)致JC-10以單體形式存在于胞質(zhì)內(nèi)并發(fā)出綠色熒光。不同濃度的Ang-Ⅱ作用細(xì)胞12小時(shí)后,A、B、C、D組細(xì)胞的線粒體膜電位減低水平(%)為26.98±4.46、41.74±4.24、60.47±4.52、70.16±3.07。實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組線粒體膜電位下降明顯,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。3各組細(xì)胞凋亡檢測(cè)細(xì)胞凋亡顯示,不同濃度的Ang-Ⅱ作用于細(xì)胞后,各組的早期凋亡率及晚期凋亡率分別為4.0%、1.8%,10.8%、2.9%,5.2%、8.2%,1.4%、15%。實(shí)驗(yàn)組B組的早期凋亡率高于A組,隨著Ang-Ⅱ濃度的增加早期凋亡減少,晚期凋亡增加。結(jié)論:1 Ang-Ⅱ下調(diào)HUVECs TFAM表達(dá)量;2 Ang-Ⅱ增加線粒體膜電位的下降率;3 Ang-Ⅱ增加細(xì)胞的凋亡率。
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【學(xué)位授予單位】：承德醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R543.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳斌偉;楊進(jìn)順;黃彥;廖壯文;;骨關(guān)節(jié)炎患者線粒體轉(zhuǎn)錄因子A表達(dá)與線粒體DNA拷貝數(shù)關(guān)系的研究[J];臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2015年12期

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本文編號(hào)：2310114