【摘要】：研究背景:隨著人們生活水平的提高和飲食習(xí)慣的改變,心血管疾病(CVD)已成為威脅人類健康的重大疾病,盡管近些年來(lái),藥物及血管再通術(shù)取得了極大的進(jìn)步,但CVD的發(fā)病率和病死率仍然居高不下。其中,又以冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(CHD)對(duì)人類健康的威脅最大,冠心病及其并發(fā)癥可導(dǎo)致嚴(yán)重的心血管事件,嚴(yán)重降低患者的生存時(shí)間和生活質(zhì)量。傳統(tǒng)的冠心病治療手段(包括藥物治療、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù))雖可改善心肌供血、挽救瀕死心肌細(xì)胞、延緩心臟重塑,顯著改善冠心病患者的整體預(yù)后和生活質(zhì)量,但卻無(wú)法從根本上修復(fù)已經(jīng)壞死的心肌細(xì)胞。對(duì)于發(fā)生急性大面積心肌梗死的患者而言,大量心肌細(xì)胞短時(shí)間內(nèi)發(fā)生缺氧、壞死,逐漸被不具備收縮功能的纖維組織替代,從而形成疤痕并發(fā)生心臟重塑,并最終導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生。近年來(lái)興起的干細(xì)胞治療為心肌再生治療提供了良好的細(xì)胞工具。已有多種自體/非自體干細(xì)胞被用于急性心肌梗死后的動(dòng)物和臨床前研究,其中一些取得了較好的療效。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(i PSCs)是通過(guò)將干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體導(dǎo)入成體細(xì)胞后制備而成的多能干細(xì)胞,具有與胚胎干細(xì)胞(ESCs)類似的自我更新和多向分化潛能,理論上可分化成為來(lái)源于三個(gè)胚層的任意細(xì)胞種類。除具有與胚胎干細(xì)胞類似的特性外,i PSCs尚具有以下ESCs所不具備的諸多優(yōu)勢(shì):1.無(wú)免疫原性;2.無(wú)倫理學(xué)爭(zhēng)議;3.可制備成為疾病特異性的個(gè)體化細(xì)胞模型。近年來(lái),i PSCs心肌定向分化率不斷提高,使其在干細(xì)胞心肌再生治療、疾病特異性細(xì)胞模型建立、藥物心臟毒性監(jiān)測(cè)等方面的應(yīng)用取得了長(zhǎng)足的發(fā)展。自噬是指細(xì)胞質(zhì)內(nèi)具有雙側(cè)膜結(jié)構(gòu)的囊泡吞噬自身胞質(zhì)內(nèi)長(zhǎng)壽蛋白質(zhì)或細(xì)胞器,并與溶酶體結(jié)合后形成自噬溶酶體,隨后降解其內(nèi)容物的過(guò)程。自噬是細(xì)胞自身固有的一種防御機(jī)制,對(duì)維持細(xì)胞自穩(wěn)態(tài)和保持細(xì)胞器的更新至關(guān)重要。有研究表明,自噬不僅與胚胎期心臟發(fā)育密切相關(guān),同時(shí)也參與調(diào)控干細(xì)胞的體外心肌分化過(guò)程。但有關(guān)自噬對(duì)于人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞心肌定向分化的影響和具體機(jī)調(diào)控機(jī)制尚未見報(bào)道。研究目的:1.觀察自噬對(duì)hi PSCs心肌細(xì)胞分化效率的影響。2.探索自噬調(diào)控hi PSCs心肌細(xì)胞分化的具體機(jī)制。研究方法:1.培養(yǎng)hi PSCs并進(jìn)行干細(xì)胞標(biāo)志物Oct4免疫熒光染色,驗(yàn)證其干細(xì)胞特性。2.使用懸浮法誘導(dǎo)hi PSCs形成擬胚體,優(yōu)化自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(Rapamycin)和自噬抑制劑氯化銨(NH4Cl)調(diào)控h EB自噬水平的條件。實(shí)驗(yàn)分組如下:(1)對(duì)照組;(2)雷帕霉素處理組(Rapa組);(3)雷帕霉素+10m M氯化銨組(R+N組),采用不同濃度的Rapamycin處理細(xì)胞,通過(guò)蛋白印跡實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞自噬水平變化,通過(guò)對(duì)自噬相關(guān)蛋白LC3免疫熒光染色、透射電鏡計(jì)數(shù)自噬小體等方法檢測(cè)各組間細(xì)胞自噬水平變化。3.采用優(yōu)化后的自噬誘導(dǎo)條件,對(duì)hi PSCs心肌定向分化過(guò)程的不同階段進(jìn)行干預(yù),通過(guò)擬胚體搏動(dòng)區(qū)域計(jì)數(shù)、心肌細(xì)胞標(biāo)志物c Tn T和MEF-2c表達(dá)水平篩選自噬調(diào)控hi PSCs心肌分化的最優(yōu)條件;隨后采用上述實(shí)驗(yàn)中得到的處理?xiàng)l件進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)分組:(1)對(duì)照組;(2)雷帕霉素處理組(Rapa組);(3)雷帕霉素+氯化銨組(R+N組)。通過(guò)擬胚體搏動(dòng)區(qū)域計(jì)數(shù)、心臟發(fā)育特異性標(biāo)志物m RNA和蛋白水平檢測(cè)等手段對(duì)自噬調(diào)控hi PSCs心肌細(xì)胞定向分化效率的過(guò)程進(jìn)行觀察;4.對(duì)上述實(shí)驗(yàn)分組細(xì)胞采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)不同自噬水平下細(xì)胞內(nèi)經(jīng)典Wnt通路的活性進(jìn)行測(cè)定,檢測(cè)各組間經(jīng)典Wnt通路中的關(guān)鍵通路蛋白Dishevelled 2(Dvl 2)的表達(dá)水平;使用GSK-3β抑制劑CHIR-99021模擬激活經(jīng)典Wnt通路活性,通過(guò)擬胚體搏動(dòng)區(qū)域計(jì)數(shù)觀察h EB心肌細(xì)胞分化效率;探討自噬調(diào)控經(jīng)典Wnt通路的具體機(jī)制。研究結(jié)果:1.hi PSCs在光鏡下呈克隆生長(zhǎng),生長(zhǎng)狀態(tài)良好的克隆呈近圓形、邊界清晰、克隆內(nèi)細(xì)胞排列緊密、外觀均一,與周邊飼養(yǎng)層細(xì)胞分界清晰,干細(xì)胞標(biāo)志物OCT4染色呈陽(yáng)性;2.Westernblot檢測(cè)結(jié)果表明,與對(duì)照組和其他濃度處理組相比,濃度為1μM的rapamycin處理擬胚體48h后,自噬蛋白LC3II/LC3I比值最大,自噬底物蛋白P62表達(dá)最低,即為誘導(dǎo)h EB自噬最佳條件;使用上述條件進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):(1)與對(duì)照組相比,Rapa組和R+N組LC3熒光點(diǎn)數(shù)量均顯著增加;(2)與對(duì)照組相比,Rapa組自噬體數(shù)量顯著增加,R+N組自噬體數(shù)量顯著減少;3.與對(duì)照組和其他時(shí)間處理組相比,在誘導(dǎo)分化第4-6天對(duì)h EB進(jìn)行干預(yù)后,所得到的擬胚體所含搏動(dòng)區(qū)域比例最高,同時(shí)心肌特異性標(biāo)志物β-MHC、MEF-2c和c Tn T的m RNA表達(dá)量最高;進(jìn)一步研究結(jié)果表明:(1)與對(duì)照組相比,Rapa組中搏動(dòng)區(qū)域數(shù)量、心肌分化特異性標(biāo)志物GATA4、Nkx2.5、Tbx5、c Tn T的m RNA表達(dá)含量均顯著增高,相應(yīng)基因表達(dá)水平在R+N組均顯著降低;(2)與對(duì)照組相比,c Tn I陽(yáng)性細(xì)胞率在Rapa組顯著增高,而在R+N組顯著降低;(3)心肌特異性蛋白MEF-2c和c Tn I表達(dá)量在Rapa組顯著增高,在R+N組顯著降低;4.與對(duì)照組相比,經(jīng)典Wnt/β-catenin通路下游基因Axin2、c-Myc、Cyclin D1表達(dá)量在Rapa組顯著下調(diào),在R+N組顯著上調(diào),表明激活自噬可抑制Wnt通路的活性;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),Rapa組Dvl2蛋白表達(dá)顯著下調(diào),R+N組Dvl2蛋白表達(dá)則顯著上調(diào),表明自噬可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt通路蛋白Dvl2的含量來(lái)調(diào)控經(jīng)典Wnt通路。加入GSK-3β抑制劑CHIR-99021上調(diào)wnt通路活性后,各組Wnt下游蛋白β-catenin表達(dá)含量均顯著上調(diào)。此外,與未加藥組相比,加藥組擬胚體搏動(dòng)區(qū)域數(shù)量顯著下調(diào),表明自噬可能是部分通過(guò)對(duì)Wnt/β-catenin通路的負(fù)性調(diào)控來(lái)發(fā)揮對(duì)hi PSCs的心肌分化效率的調(diào)節(jié)。研究結(jié)論:1.自噬可促進(jìn)人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞向心肌定向分化的效率;2.自噬對(duì)hi PSCs心肌定向分化效率的促進(jìn)部分是通過(guò)對(duì)經(jīng)典wnt/β-catenin通路活性的負(fù)性調(diào)節(jié)而實(shí)現(xiàn)的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R54

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本文編號(hào)：2309392