【摘要】：目的:內皮細胞(endothelial cell,EC)功能失調和血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)表型轉化與心血管疾病密切相關。平滑肌22 alpha(smooth muscle 22 alpha,SM22α)是細胞骨架相關蛋白,在分化型VSMC中高表達,參與細胞骨架重構和VSMC表型調節(jié)。缺失SM22α可加劇血管炎癥。SM22α對VSMC的作用已得到充分證實,但其對VSMC的作用是否影響EC的功能尚無研究報道。本研究采用野生型(wild-type,WT)和SM22α基因敲除(SM22α-/-)小鼠VSMC條件培養(yǎng)基(VSMC conditioned medium,VSMC-CM)分別處理EC,觀察其對EC功能的影響。方法:1應用Ang II處理C57BL/6 WT及SM22α-/-小鼠VSMC 24 h,收集細胞,采用免疫共沉淀和雙熒光免疫染色檢測VCAM-1與SMα-actin的相互作用。2收集Ang II處理24 h的VSMC-CM,孵育人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)24 h后,Western blot檢測HUVEC中eNOS和MCP-1的表達,分析培養(yǎng)基NO含量。3應用WT或SM22α-/-VSMC條件培養(yǎng)基處理HUVEC,跨膜遷移分析檢測不同培養(yǎng)條件下HUVEC對單核巨噬細胞趨化活性的影響。結果:1 SM22α缺失促進AngII誘導的VSMC膜結合型VCAM-1的表達為觀察F-actin與膜表面VCAM-1表達之間的關系,首先分離細胞F-actin組分,用抗SMα-actin抗體沉淀,所得沉淀組分用Western blot檢測與SMα-actin結合的VCAM-1。結果顯示,從未刺激的WT VSMC F-actin中幾乎檢測不到VCAM-1;而靜止狀態(tài)的SM22α-/-VSMC的F-actin組分可檢測出少量結合的VCAM-1;在Ang II刺激后,與WT相比,SM22α-/-VCAM-1與SMα-actin的結合活性顯著增加。細胞免疫熒光染色結果顯示,在WT VSMC中,F-actin呈束狀,平行排列,而在SM22α-/-VSMC中,F-actin稀疏,主要分布在細胞皮層邊緣區(qū);與WT相比較,AngII誘導的SM22α-/-細胞皮層F-actin與VCAM-1共定位熒光強度增強,其主要分布于細胞膜表面,與免疫共沉淀結果一致。結果表明,SM22α缺失促進VSMC膜表面結合型VCAM-1的表達,這與細胞皮層F-actin的相互作用增強有關。2 SM22α-/-VSMC條件培養(yǎng)基抑制內皮細胞eNOS表達,NO釋放減少為了研究VSMC缺失SM22α是否誘導EC功能障礙,用Western blot檢測HUVEC eNOS表達。結果顯示,與WT比較,Ang II處理和未處理的SM22α-/-VSMC-CM對內皮細胞eNOS表達均有抑制作用;并且,AngII處理24 h的SM22α-/-VSMC-CM抑制HUVEC中eNOS表達的作用比WT更加明顯(P0.01)。對HUVEC培養(yǎng)基中NO含量進行分析,結果顯示,各組細胞NO釋放量的變化趨勢與eNOS表達變化具有平行關系,SM22α-/-VSMC-CM處理的HUVEC其NO合成明顯低于野生組(P0.01)。3 SM22α-/-VSMC條件培養(yǎng)基誘導內皮細胞MCP-1分泌增多為了證實SM22α-/-VSMC外泌物對EC是否有激活作用,檢測HUVEC培養(yǎng)基中MCP-1的表達量。Western blot分析顯示,SM22α-/-VSMC-CM處理的內皮細胞其培養(yǎng)基MCP-1表達量明顯高于野生型處理組,而且,比較AngII處理后的誘導活性,SM22α-/-比WT升高更加明顯(P0.05)。細胞跨膜遷移實驗結果顯示,被VSMC-CM處理的內皮細胞外泌物可增加巨噬細胞跨膜遷移活性,而且與MCP-1的表達量呈正相關關系。結果表明缺失SM22α后AngII誘導的VSMC旁分泌可誘導EC功能失調進而加劇血管炎癥。結論:1缺失SM22α促進VSMC炎癥應答;2缺失SM22α的VSMC旁分泌誘導EC功能失調。
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【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R54

【參考文獻】

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本文編號：2300413