【摘要】：目的:前期采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),研究重型再生障礙性貧血(Severe aplastic anemia,SAA)患者與正常人髓樣樹突狀細(xì)胞(m DC)和骨髓CD34+細(xì)胞的差異蛋白質(zhì)成份,初步篩選有同源性的差異蛋白質(zhì),即激活SAA免疫反應(yīng)可能的抗原物質(zhì),研究SAA患者m DC及CD34+細(xì)胞內(nèi)差異蛋白質(zhì)表達(dá)水平,與患者臨床資料的相關(guān)性,及其對m DC、效應(yīng)T細(xì)胞及靶細(xì)胞的影響,探討此差異蛋白質(zhì)調(diào)控SAA自身免疫狀態(tài)的機(jī)制及其在SAA發(fā)病中的作用,為進(jìn)一步闡明SAA免疫發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。構(gòu)建免疫介導(dǎo)骨髓衰竭小鼠模型,評(píng)價(jià)模型的免疫狀態(tài),通過SAA小鼠模型分析差異蛋白質(zhì)在小鼠體內(nèi)表達(dá)水平,為后續(xù)探索SAA免疫發(fā)病的始動(dòng)因素、指導(dǎo)免疫抑制劑的臨床應(yīng)用、減少病情復(fù)發(fā),提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:選取天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院血液科,自2014年4月至2017年4月收治的未經(jīng)治療的初治SAA患者(初診組)、經(jīng)免疫抑制治療后緩解的SAA患者(恢復(fù)組)及正常對照者作為研究對象。C57BL/6小鼠,BALB/c小鼠,CBy B6F1小鼠,飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,SPF級(jí)動(dòng)物房。第一部分:初步探索致SAA免疫激活成因的靶抗原物質(zhì)。課題組前期,采用體外誘導(dǎo)培養(yǎng)將SAA患者及正常人的單核細(xì)胞,分化為成熟的m DC,流式細(xì)胞儀分選得到高純度m DC,提取總蛋白,進(jìn)行雙向電泳分離蛋白質(zhì),取差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行比對,明確SAA患者m DC內(nèi)與正常人不同的蛋白質(zhì)成分。應(yīng)用免疫磁珠法分選SAA患者及正常人骨髓CD34+細(xì)胞,提取總蛋白,將蛋白質(zhì)酶解,應(yīng)用i TRAQ標(biāo)記樣品,應(yīng)用多維液相色譜分離樣品并串聯(lián)質(zhì)譜Q Exactive進(jìn)行蛋白質(zhì)分析,應(yīng)用數(shù)據(jù)庫檢索鑒定蛋白質(zhì),并比較這些蛋白質(zhì)的表達(dá)差異。本部分對SAA患者與健康人m DC與CD34+細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)中篩選出的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行同源性比對,明確SAA患者m DC與CD34+細(xì)胞內(nèi)差異蛋白質(zhì)成分有無同源性或交叉性,即導(dǎo)致SAA發(fā)病可能的抗原物質(zhì)。第二部分:檢測篩選出的差異蛋白質(zhì)成分在SAA及正常人體內(nèi)的表達(dá)。選取26例SAA初治患者、22例SAA恢復(fù)期患者及18名健康正常人,采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測SAA患者m DC與CD34+細(xì)胞內(nèi)同源性差異蛋白質(zhì)成分白細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(leukocyte immunoglobulin like receptors,LILRs)A亞型在m DC細(xì)胞、CD34+細(xì)胞、CD3+CD8+等多種細(xì)胞內(nèi)表達(dá);實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)檢測骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNC)、m DC細(xì)胞、CD34+細(xì)胞內(nèi)其mRNA相對表達(dá)水平;使用免疫印跡法(Western Blot)檢測SAA患者LILRA表達(dá)。同期檢測上述SAA患者m DC細(xì)胞數(shù)量,增殖、活化因子表達(dá);CD34+細(xì)胞數(shù)量,凋亡、細(xì)胞因子表達(dá);CD3+CD4+/CD3+CD8+比值、Th1/Th2比例、CTL細(xì)胞數(shù)量,功能、細(xì)胞因子表達(dá);分析其與上述檢測結(jié)果及SAA患者病情進(jìn)行相關(guān)性分析。第三部分:體外細(xì)胞模型驗(yàn)證篩選出的差異蛋白質(zhì)成分LILRA對m DC的激活作用,并驗(yàn)證骨髓靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)篩選出的差異蛋白質(zhì)成分而受到CTL攻擊。應(yīng)用RNAi敲除差異蛋白質(zhì)成分,分選SAA患者及正常健康人的CD11C+HLA-DR+細(xì)胞作為m DC細(xì)胞,分選CD8+MHC-I+T細(xì)胞作為效應(yīng)CTL細(xì)胞,分選CD34+細(xì)胞或陰性分選去除CD3+T細(xì)胞后作為靶細(xì)胞;體外將m DC細(xì)胞與CTL細(xì)胞混合培養(yǎng),檢測基因表達(dá)減低前后m DC細(xì)胞抗原遞呈功能變化,m DC細(xì)胞對CTL激活的作用;體外將CTL細(xì)胞與靶細(xì)胞混合培養(yǎng),檢測基因表達(dá)減低前后CTL對造血靶細(xì)胞的凋亡作用。第四部分:初步建立免疫介導(dǎo)的骨髓衰竭小鼠模型。模型小鼠經(jīng)非致死劑量照射后,其造血干細(xì)胞和骨髓微環(huán)境損傷嚴(yán)重,當(dāng)輸入次要組織相容性抗原不合的小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞后,可進(jìn)一步誘導(dǎo)免疫性骨髓造血功能損傷的模型。檢測血細(xì)胞計(jì)數(shù)、骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)及形態(tài);骨髓細(xì)胞培養(yǎng)克隆形成實(shí)驗(yàn),脾臟、肝臟和骨髓組織病理;流式細(xì)胞術(shù)檢測骨髓LSK及人LILRs在鼠類的同源物成對的免疫球蛋白樣受體(paired immunoglobulin-like receptors,PIRs)的表達(dá)。結(jié)果:第一部分:課題組前期鑒定SAA患者與健康正常人m DC細(xì)胞蛋白成分的差異表達(dá),其中20個(gè)在初診組上調(diào),21個(gè)在初診組下調(diào)。課題組前期明確SAA患者與健康正常人CD34+細(xì)胞蛋白成分的差異表達(dá),其中54個(gè)在初診組上調(diào),103個(gè)在初診組下調(diào)。我們對在初診組表達(dá)上調(diào)的差異蛋白分別進(jìn)行同源性或交叉性對比。我們發(fā)現(xiàn)與正常人的m DC細(xì)胞相比,SAA患者m DC細(xì)胞內(nèi)白細(xì)胞免疫球蛋白樣受體A3(leukocyte immunoglobulin like receptor A3,LILRA3)表達(dá)增高;與正常人的CD34+細(xì)胞相比,SAA患者CD34+細(xì)胞內(nèi)白細(xì)胞免疫球蛋白樣受體A5(LILRA5)表達(dá)增高;經(jīng)BLAST序列比對及文獻(xiàn)結(jié)構(gòu)分析顯示LILRA3與LILRA5胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列高度同源,具有高結(jié)構(gòu)同源性,并與相同的MHC-I配體結(jié)合。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測其BMMNC LILRA(1-6)mRNA相對表達(dá)水平,SAA初診組LILRA3 mRNA相對表達(dá)水平(3.51±3.29)明顯高于正常對照組(1.37±0.96)(P0.05),恢復(fù)組(2.45±1.77)明顯高于正常對照組(P0.05),初診組和恢復(fù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,SAA組LILRA5mRNA相對表達(dá)水平較正常對照組有升高趨勢,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第二部分:檢測LILRA在SAA及正常人體內(nèi)的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)檢測SAA初診組骨髓LILRA3+/CD34+比例[(47.05±32.07)%]明顯高于正常對照組[(14.26±14.00)%](P0.05),恢復(fù)組[(39.86±19.46)%]高于正常對照組(P0.05)。SAA初診組骨髓LILRA3+/CD11C+HLA-DR+比例[(73.11±22.54)%]明顯高于正常對照組[(48.64±38.03)%](P0.05),恢復(fù)組[(60.22±23.69)%]和正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。q RT-PCR技術(shù)檢測m DC細(xì)胞內(nèi)LILRA3 mRNA相對表達(dá)水平,初診SAA患者m DC細(xì)胞內(nèi)LILRA3 mRNA相對表達(dá)水平(1.79±1.30)明顯高于正常對照組(0.77±0.72)(P0.05),初診組和恢復(fù)組(1.47±0.99)、恢復(fù)組和正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western Blot顯示初診組患者m DC細(xì)胞內(nèi)LILRA3蛋白水平明顯升高。SAA組骨髓LILRA3+/CD34+比例與血小板數(shù)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.497,P0.05),與血紅蛋白數(shù)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.427,P0.05),SAA組骨髓LILRA3+/CD34+比例與LILRA3+/CD11c+HLA-DR+比例呈正相關(guān)(r=0.330,P0.05),LILRA3+/CD11c+HLA-DR+比例與LILRA3 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.344,P0.05)。第三部分:體外細(xì)胞模型分選m DC細(xì)胞,CD8+T細(xì)胞,CD34+細(xì)胞及陰性分選CD3-T細(xì)胞;檢測LILRA3的配體HLA-A/B/C在CD8+T細(xì)胞上的表達(dá),結(jié)果顯示HLA-A/B/C+/CD3+CD8+比例在SAA初診組、恢復(fù)組和正常對照組比較均無顯著性差異;敲低m DC和靶細(xì)胞LILRA3表達(dá)后,我們分別檢測了混合培養(yǎng)后CTL的功能效應(yīng)分子CD178(Fas L)的表達(dá),以及CD34+細(xì)胞凋亡分子CD95(Fas)的表達(dá),結(jié)果示初診SAA患者(組1)CD178+/CD3+CD8+的比例[(14.22±6.74)%]明顯高于(組2)初診SAA患者m DC細(xì)胞與正常對照者CTL混合培養(yǎng)組[(4.53±1.73)%]和(組3)初診SAA患者LILRA3表達(dá)減低的m DC細(xì)胞與正常對照者CTL混合培養(yǎng)組[(4.67±1.60)%](P0.05),組2和組3比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。初診SAA患者(組1)CD95+/CD34+的比例[(78.24±27.60)%],初診SAA患者CD34+/靶細(xì)胞與正常對照者CTL混合培養(yǎng)組(組2)[(62.24±16.18)%],初診SAA患者LILRA3表達(dá)減低的CD34+/靶細(xì)胞與正常對照者CTL混合培養(yǎng)組(組3)[(46.59±26.00)%],三組比較均無顯著性差異(P0.05)。初診SAA患者(組1)靶細(xì)胞凋亡率為[(39.86±15.91)%],初診SAA患者CD34+/靶細(xì)胞與正常對照者CTL混合培養(yǎng)組(組2)[(35.03±21.09)%],初診SAA患者LILRA3表達(dá)減低的CD34+/靶細(xì)胞與正常對照者CTL混合培養(yǎng)組(組3)[(36.03±22.09)%],三組比較均無顯著性差異(P0.05)。初診SAA患者(組1)CTL細(xì)胞活性為[(2.27±1.76)%]明顯高于初診SAA患者LILRA3表達(dá)減低的m DC細(xì)胞與正常對照者CTL混合培養(yǎng)組(組3)[(1.39±0.25)%](P0.05),初診SAA患者m DC細(xì)胞與正常對照者CTL混合培養(yǎng)組(組2)[(2.87±1.06)%]和其它兩組比較均無顯著性差異(P0.05)。第四部分:初步建立免疫介導(dǎo)的骨髓衰竭小鼠模型。實(shí)驗(yàn)組小鼠先接受5.0-6.0 Gy的Cesium-137γ射線(劑量率1.0 Gy/min)全身照射后,4-6小時(shí)內(nèi)將C57BL/6(H2b/b)小鼠淋巴細(xì)胞懸液(5-10×106個(gè)細(xì)胞)通過眼眶靜脈注射到CBy B6F1(H2b/d)小鼠體內(nèi),于注射C57BL/6小鼠淋巴細(xì)胞后第14天采集外周血,結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠外周全血細(xì)胞減少率為100%,死亡率15%,小鼠重度全血細(xì)胞減少,網(wǎng)織紅細(xì)胞和中性粒細(xì)胞絕對值減少,均明顯低于正常對照組和TBI照射組,組織活檢示骨髓增生顯著減低,有效造血容積15-20%,粒紅系顯著減低,全片未見巨核細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組小鼠骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯低于TBI照射組和正常對照組,CFU-GM、CFU-E、BFU-E、CFU-GEMM各集落形成單位計(jì)數(shù)明顯低于TBI照射組和正常對照組,HPC和HSC計(jì)數(shù)明顯低于TBI照射組和正常對照組,實(shí)驗(yàn)組小鼠符合AA動(dòng)物模型的判斷標(biāo)準(zhǔn)。FCM檢測實(shí)驗(yàn)組PIR-A/B+/CD34+比例[(42.41±9.97)%],TBI照射組[(42.00±12.50)%]和正常對照組[(48.08±7.58)%]三組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),實(shí)驗(yàn)組PIR-A/B+CD8+/CD3+比例[(2.89±1.57)%]明顯低于TBI照射組[(19.63±12.50)%]和正常對照組[(23.77±10.58)%](P0.05)。實(shí)驗(yàn)組PIR-A/B+/CD11c+比例[(50.08±20.65)%]明顯低于正常對照組[(72.03±17.55)%](P0.05),TBI照射組[(58.62±7.42)%]明顯低于正常對照組(P0.05)。結(jié)論:(1)經(jīng)BLAST序列比對及文獻(xiàn)結(jié)構(gòu)分析顯示SAA患者mDC細(xì)胞內(nèi)表達(dá)增高的LILRA3與SAA患者CD34+細(xì)胞內(nèi)表達(dá)增高的LILRA5胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列高度同源,具有高結(jié)構(gòu)同源性。(2)進(jìn)一步驗(yàn)證顯示LILRA3在SAA患者m DC細(xì)胞和CD34+細(xì)胞內(nèi)基因水平或是蛋白水平均表達(dá)明顯增高。LILRA3+/CD34+比例與LILRA3+/CD11c+HLA-DR+比例呈正相關(guān),LILRA3+/CD11c+HLA-DR+比例與LILRA3mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān),LILRA3+/CD34+比例與血小板數(shù)量呈負(fù)相關(guān),與血紅蛋白數(shù)量呈負(fù)相關(guān),并且與疾病進(jìn)程呈現(xiàn)相關(guān)性。(3)SAA患者m DC細(xì)胞內(nèi)升高的LILRA3參與了m DC細(xì)胞活化過程,刺激CTL功能分子表達(dá)水平升高,功能亢進(jìn);而骨髓靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)升高的LILRA3可使CTL增強(qiáng)對靶細(xì)胞的殺傷作用。(4)成功建立SAA小鼠模型,并通過SAA小鼠模型分析PIR-A/B表達(dá)水平。SAA患者LILRA3表達(dá)異常,數(shù)量增加,功能亢進(jìn),且表達(dá)水平與免疫功能狀態(tài)的變化具有一致性,隨著治療有效,逐漸趨于正常。LILRA3在SAA免疫發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用,LILRA3有可能成為該疾病潛在的治療靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R556.5

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本文編號(hào)：2288053